Частота ошибок у pfu полимеразы на пару нуклеотидов - Исправление ошибок и поиск оптимальных решений проблем

Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules Part A

Milton H. Werner, … Takashi Nagata, in Methods in Enzymology, 2002

PCR Amplification of Tandemly Repeated Oligonucleotides

Reagents

Pfu DNA polymerase (ATCC 87496)

Whatman P11 phosphocellulose

Anion-exchange resin

Polyethyleneimine (Fluka)

(NH₄)₂SO₄ (ultrapure enzyme grade)

10 × Pfu PCR buffer: 200 mM Tris-HCl, pH 8.8, 100 mM KCl, 100 mM (NH₄)SO₄, 1.0% Triton X-100, 1.2 mg/ml bovine serum albumin (BSA)

100 mM MgSO₄

20 mM labeled dNTPs

Gel-purified oligonucleotide templates

EcoRV (Promega, Madison, WI)

Equipment

Thermal cycler (non-Peltier model preferred)

2.6 × 20 cm medium pressure chromatography column

2.5 × 10 cm Vydac 301 VHP DEAE HPLC column

Procedures

1.Preparation of Pfu polymerase. The expression vector for Pfu polymerase is transformed into E. coli HMS174(DE3) pLysS using standard procedures.²⁵ The cells can be grown by conventional methods and induced with 0.4 mM IPTG for 4 hr. The cells are harvested by centrifugation at 5000 g and lysed in 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM Na₂EDTA, 10 mM benzamidine hydrochloride using the homogenization/French press approach described under “Preparation of bulk nucleic acids.” Unless indicated otherwise, all subsequent steps should be performed at 4°. The lysate is clarified by centrifugation at 5000 g and the nucleic acids precipitated by the addition of 7.5 ml 10% (v/v) polyethyleneimine per 100 ml lysate. The white precipitate is removed by centrifugation at 5000 g. The supernatant is transferred to a 500 ml centrifuge bottle and heated in a water bath at 74° for 20 min, then rapidly chilled on ice. Most E. coli proteins will be precipitated at this stage and can be removed by centrifugation. Pfu polymerase is then precipitated by adding solid ammonium sulfate to 85% saturation. The protein precipitate is recovered by centrifugation at 10,000 g, resuspended in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5,1 mM Na₂EDTA, 10 mM benzamidine hydrochloride and dialyzed against 4 liters of the same at 4° for at least 12 hr. The protein solution is centrifuged at 100,000 g for 1 hr and loaded at 1.5 ml/min onto a 2.6 × 20 cm column of Whatman P11 (phosphocellulose) equilibrated with 50 mM Tris-HCl, pH 7.5. Pfu polymerase is eluted with a two column volume gradient from 0→1.2 M NaCl. Pfu polymerase elutes at approximately 180 mM NaCl. The eluted fractions are pooled, dialyzed against 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, until the measured conductivity of the protein solution is within twofold of the buffer. Pfu is further purified by Mono Q (1.6 × 20 cm) (or any quaternary anion-exchange resin) using a 5 column volume linear gradient from 0 to 18% 1 M KCl. Pfu polymerase elutes in three chromatographically distinct peaks, with the most abundant fraction retained for use as a thermal cycling enzyme. The main fraction is pooled and dialyzed against 10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 0.2 mM EDTA extensively. The protein solution is then analyzed for purity by SDS-PAGE and concentrated by ultrafiltration to 1.3 mg/ml. Nuclease digestion assays should be performed to confirm that no nuclease has copurified with the enzyme. The protein is then diluted 2 × with 2 mM DTT, 0.2% (v/v) NP-40, 0.2% (v/v) Tween 80, 100% (w/v) glycerol, and aliquoted for storage at –20°. Long-term storage can be at –80°, but the enzyme should not be repeatedly thawed and refrozen at this temperature. One μl of a fivefold dilution of enzyme is typically adequate for standard (cloning-type) PCR reactions. Undiluted enzyme is used for the thermal cycling procedure described below.

2.PCR amplification of tandemly repeated oligonucleotide templates. DNA synthesis is conducted in 40 × 500 μl thin-walled reaction vials in a gradient thermal cycler equipped with a “hot” top to avoid the use of mineral oil. A tandem repeat of the desired sequence is synthesized at the 1 μmol scale without trityl groups and gel purified on sequencing length gels.²⁵ The two step reaction procedure is similar in design to the concatemer chain reaction of Thompson and co-workers²¹ as well as the adaptation of this approach to DNA-labeling by Louis et al.,¹⁶ with the exception that the anealing temperature in each step is optimized for each template sequence using an optimized cycling protocol (Figs. 5 and 6). In step 1, the anealing temperature is optimized by systematic variation over 14° and examining the total nucleic acid content and length distribution of the product DNA by 0.7% agarose gel electrophoresis (Fig. 6a and Table I). For step 2, the annealing temperature is optimized over a similar temperature range by quantifying the digested DNA product in 15% polyacrylamide gels (0.5 × TBE) (Fig. 6b and Table I).

Fig. 5. PCR amplification of tandemly repeated templates. A two-step synthesis is employed,^16,21 the first of which prepares a self-priming/self-propagating template pool and the second of which synthesizes long, tandemly repeated DNA. The course of synthesis is followed by 0.7% agarose gel electrophoresis (right). (a) A tandem repeat of the desired sequence is added to the reaction mixture as a blunt-ended duplex. (b) Thermal cycling converts the blunt-ended duplex into a self-priming repeat, creating a pool of different length DNAs. (c) Step 1 products serve as templates for a second round of amplification. The step 1 products are diluted 10-fold into a series of step 2 reactions that create long tandem repeats. At the beginning of step 2, additional duplex DNA containing a single repeat of the desired sequence can be added to increase the overall yield by as much as twofold. Extensive thermal cycling (d) followed by restriction with EcoRV (e) results in milligram quantities of single-length DNA product of the desired sequence.

Fig. 6. Optimization of synthetic yield by gradient thermal cycling. An example of the annealing temperature optimization procedure for template 2 involves two different tests that can be performed with unlabeled dNTPs. (a) Optimization of step 1 annealing temperature. Ten l of 500 l step 1 reactions are analyzed with 0.7% agarose gels that display the length distribution and total quantity of nucleic acid at different annealing temperatures. The bar graph quantitates the total fluorescentintensity, expressed in fluorescent “counts” in a Molecular Dynamics Storm System, illustrating that the total nucleic acid content is roughly equal at T₁ = 49°,51°, and 57°. However, the length distribution varies widely at these three annealing temperatures as evidenced by the extent of smearing in the gel lanes. it is preferable to use the annealing temperature that displays a wide length distribution and maximal total nucleic acid content so that efficient priming in step 2 occurs. For this reason, the T₁ = 49° nucleic acid pool was chosen for further amplification in step 2. (b) Optimization of step 2 annealing temperature. Ten μl of 500 μl reaction is analyzed with 15% polyacrylamide, 0.5 × TBE gels following EcoRV digestion as described in the text. For T₁ = 49°, priming in step 2 is more efficient overall when compared to T₁ = 55° as evidenced by the higher product yield in three of the four reactions shown. This reflects not only the higher total nucleic acid content of the T₁ = 49 °C reaction relative to T₁ = 55°, but also the greater dispersion in product lengths at T₁ = 49°. The greatest product yield is observed for the T₁ = 49°/T₂ = 65° combination in this example (see Table I).

Table I. DNA Templates and Target Sequences for ULTRA^a

DNA template	Product sequence
ATCAGGATGCGGTTACTGATATCAGGATGCGGTTACTGATTAGTCCTACGCCAATGACTATAGTCCTACGCCAATGACTA 1	ATCAGGATGCGGTTACTGATTAGTCCTACGCCAATGACTA 2
ATCCAGAGGATGTGGCTTCTGATATCCAGAGGATGTGGCTTCTGAT TAGGTCTCCTACACCGAAGACTATAGGTCTCCTACACCGAAGACTA 3	ATCCAGAGGATGTGGCTTCTGAT TAGGTCTCCTACACCGAAGACTA 4
ATCGTTTGTCGATATCGTTTGTCGAT TAGCAAACAGCTATAGCAAACAGCTA 5	ATCGTTTGTCGAT TAGCAAACAGCTA 6

a: ULTRA: Uniform Labeling by Tandem Repeat Amplification. EcoRV restriction site is shown in boldface type, a half-site at each end and full site separating the tandem repeat of desired sequence.

A typical step 1 reaction contains 0.1 μM each of gel purified template, 2 mM labeled dNTPs (0.5 mM each nucleotide), 4 mM MgSO₄, 1 × Pfu reaction buffer, and 3.25 μg recombinant Pfu DNA polymerase. Thermal cycling procedure: 95° for 5 min, 25 cycles of 95° for 45 s, T₁ for 2 min (see Table I), and 72° for 4 min.

A typical step 2 reaction contains 50 μl step 1 product, 2 mM dNTPs, 4 mM MgSO₄,1 × Pfu reaction buffer, 3.25 μg recombinant Pfu DNA polymerase. Single repeat DNA (≈ 35 pmol) derived from restriction of step 1 reaction products or by restriction of the original templates may be added in step 2 to enhance overall product yield by as much as twofold (Figs. 5 and 6). Thermal cycling procedure: 95° for 5 min followed by 60 cycles of 95° for 45 s, T₂ for 2 min (see Table I), and 78° for 4 min. Thermal cycling was followed by incubation at 78^° for 10 min.

Note on choice of thermal cycler: Although the PCR cycling scheme outlined above will work in any thermal cycler, Peltier-driven machines were found to be relatively inefficient at amplification of tandemly repeated templates. We recommend the use of a cycler that does not ramp temperature in a single block, such as the Stratagene (La Jolla, CA) Robocycler 40. For optimization of a Peltier-driven machine using 500 μl tubes, it will be necessary to actually optimize the ramping times and rates in addition to the temperature of each step in the cycle. The conditions described are the results of extensive optimization on a non-temperature-ramping thermal cycler. Under the described conditions, product yields are dependent on neither sequence composition nor length.

3.Endonuclease cleavage. The product DNA from 40 reactions is combined, DTT added to 1 mM, NaCl added to 125 mM, and MgCl₂ added to a total final concentration of 10 mM. The pH is lowered to 7.9 with HCl and the DNA digested with 150 units of EcoRV per 500 μl step 2 reaction at 37° with continual mixing for 4 hr. Another 150 units of EcoRV is added for an additional incubation of no more than 4 hr. Digestion is monitored by 15% polyacrylamide gels (0.5 × TBE) (Figs. 6 and 8).

Note: The choice of EcoRV here is essentially one of cost. Any restriction endonuclease may be used here depending on the properties of the ends that are desired.

4.Purification of product DNA and recovery of unincorporated nucleotides. Digested DNA is 0.2 μm filtered and purified by DEAE ion-exchange HPLC using a preparative Vydac 301 VHP column (Fig. 7). The column is equilibrated with 25 mM sodium phosphate, pH 7.4, 90 mM NaCl. The digested product DNA is diluted with phosphate buffer to lower the initial [NaCl] to ≤ 90 mM, injected (5 ml aliquots), washed over the column to remove unincorporated nucleotides, then eluted using a gradient of 90 mM→ 360 mM NaCl over 15 min at 10 ml/min. Fractions containing the main DNA peak were collected and dialyzed against 1 mM sodium phosphate, pH 7.0, 1 mM Na₂EDTA and concentrated by lyophilization. The yield of product DNA was determined by measuring the absorbance at 260 nm assuming 50 pg/ml per A₂₆₀ unit. A 500 μL reaction yields a minimum of 8.5 nmol of isotopically enriched single-length DNA from 5 pmol of unlabeled template, an 800: 1 product: template yield. The pool of unincorporated nucleotides can be desalted by preparative C18 RP-HPLC column as described above, lyophilized, and stored at –80° for rephosphorylation and reuse.

Fig. 7. Single-step purification of product DNA. The restricted product DNA can be purified in a single step by DEAE ion-exchange HPLC in 25 mM sodium phosphate employing a biphasic gradient. Isocratic elution of a 5 ml injection at 90 mM NaCl separates the unreacted nucleotides from the product, permitting their recovery and reuse. A linear gradient over 15 min from 90 to 360 mM NaCl elutes the product DNA as essentially a single peak.

5. Fill-in of overdigested product. Occasionally, incubation of product DNA with EcoRV longer than 12 hr results in overdigestion, creating multiple product lengths. Overdigestion results in recessed 3′ ends that can be filled-in with Klenow DNA polymerase and labeled dNTPs (Fig. 8). A typical fill-in reaction contains 0.1 mM DNA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 7.5 mM DTT, 2 mM dNTP mixture, and 50 units/ml Klenow. Fill-in is complete within 2 hr at 37°. The reaction is quenched by the addition of Na₂EDTA to 10 mM and the DNA recovered by ion-exchange chromatography as described above.

Fig. 8. Purity of product DNA and fill-in of overdigested product. (a) Purity of product DNA. 20% urea–polyacrylamide gel of product DNAs demonstrates that the product is identical in length to that derived from digested template DNA. There are two bands observed for this product, each of which represents one of the strands of the duplex DNA that are resolved in a 20% sequencing-length gel. We frequently observe a faint slower mobility band in these gels that represents product digested to only dimer length (< 0.1%). The faint ladder seen below the product bands results from slight overdigestion and represents < 0.3% of the sample. (b) Fill-in of intentionally overdigested product. Product DNA was digested for 14 hr, revealing substantial (≈ 20%) overdigestion to a length 1–2 nucleotides shorter than the main product. Fill-in with labeled dNTPs and Klenow results in only full-length product plus the small fraction of dimer as described in (a). The dimer can be removed by gel filtration, if desired.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687902382259

Marine Enzymes and Specialized Metabolism — Part A

Jingjing Yan, … Kui Hong, in Methods in Enzymology, 2018

4.2.3.3 Amplification of Au8003 and Au6298

1.

Design primer pairs of Au8003 and Au6298 according to the genomic sequence of strain 094102 (Table 5).

Table 5. Primers Used for Target Gene Cloning

Primer Name	Primer Sequence (5′–3′)
Au8003-F	CATATGATGGAGTATAAGTACTCGACC (NdeI)
Au8003-R	AAGCTTTCAAACCTTCAGCAGCTCCA (HindIII)
Au6298-F	CCCATATGATGTCTTCACCGCGTGCC (NdeI)
Au6298-R	CCAAGCTTTTATTTGGTGCGCTTGTAAA(HindIII)
Au13192-E1-S	GCGGCCGCATGCCACAAACACAATCC (NotI)
Au13192-E1-A	GCCGACTCGACAACATTATCATACAGAAACGCATACTCAAAGATATAACAAATAA
Au13192-E3-A	CATGAGCATGTCGACGAAG GGGGCGCCGGTATCGAT
Au13192-E4-S	CTTCGTCGACATGCTCATG
Au13192-E4-A	GCCGGGGCGAGGAGGATCTCGTCTCCTAGCTGCAC
Au13192-E5-S	ATCCTCCTCGCCCCGGC
Au13192-E5-A	AGTCTTCGATGTCGTCGAGCATGAGCGAGGCATTGTGTA
Au13192-E6-S	CTCGACGACATCGAAGACT
Au13192-E6-A	CTGCACCATCAACCTCGTAAGCAACCGGAACAACCCACCGGTCTTCTGCCTAACCATCTCCAAAT
Au13192-E8-S	TTACGAGGTTGATGGTGCAGATTGCGCCGGTGCGGCGGAAAGATCTCGACGGCATCTTATCAT
Au13192-E8-A	CCCTTTTGGCCGGTGTACTCTTCAGTTAGGTTCTTGTAGT
Au13192-E9-S	AGTACACCGGCCAAAAGGG
Au13192-E9-A	TCTAGATACACCTTCAACCTCTGCAC (Xba I)

2.

Prepare reaction system: 1 μL of Pfu DNA polymerase, 21 μL of sterilized deionized water, 1 μL of Pfu DNA polymerase 5 × NF buffer, 2.5 μL (10 μM) each of forward and reverse primer, and 2 μL of cDNA template.

3.

Start PCR, the reaction conditions: initial denaturation at 95°C for 3 min; denaturation at 95°C for 30 s; anneal at 53°C for 20 s; elongation at 72°C for 70 s; cycle for 35 times; elongation at 72°C for 10 min.

4.

Verify PCR products by agarose gel electrophoresis (Fig. 8A and B).

Fig. 8

Fig. 8. Target gene cloning of Au8003, Au13192, and Au6298. (A) Electrophoretic analysis of Au8003 (2350 bp) PCR product. Lane M: marker; lane 1: Au8003 PCR product. (B) Analysis of Au6298 (1102 bp) PCR product. Lane M: marker; lane 1: Au6298 PCR product. (C) Strategy of Au13192 multiple exon fusion by overlap extension PCR. (D) Electrophoretic analysis of fusion fragments in the process of Au13192 cDNA (2608 bp) fusion, respectively. (a) PCR product of each exon fragments. M: marker; E1, E3, E4, E5, E6, E8, and E9 represent for corresponding exon fragment. (b) Fusion PCR product after first round fusion. M: marker; E1:E3, E4:E5, and E6:E9 represent for fusion exon fragment E1 & E2, E4 & E5, and E6 & E8–9. (c) Au13192 cDNA after second round fusion PCR. M: marker; E: Au13192 cDNA. (E) Double digestion of cloning vectors pEASY-Blunt-Au8003, pEASY-Blunt-Au13192, pEASY-Blunt-Au6298. (a) Double digestion of pEASY-Blunt-Au8003. M: marker; lanes 1 and 3: pEASY-Blunt-Au8003 plasmid; lanes 2 and 4: pEASY-Blunt-Au8003 double digestion product. (b) Double digestion of pEASY-Blunt-Au13192. M: marker; lanes 1–3: pEASY-Blunt-Au13192 double digestion product. (c) Double digestion of pEASY-Blunt-Au6298. M: marker; lane 1: double digestion product of pEASY-Blunt-Au8003.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687918301745

POLYMERASE CHAIN REACTION

J.M. WagesJr., in Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition), 2005

Biochemical Components

DNA polymerase

A wide range of DNA polymerases is available for PCR. A cloned heat-stable DNA polymerase from Thermus aquaticus (Taq DNA polymerase) is the most commonly used. Other enzymes such as DNA polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu DNA polymerase) or Thermoccocus litoralis (Vent™ DNA polymerase, New England Biolabs) have been reported to have a lower error rate than Taq polymerase and may be advantageous for some applications. Typically, 0.5–2.5 units of enzyme are used per 50 μl reaction.

Oligonucleotide primers

Oligonucleotide primers are usually used at a concentration of 1 μmol l⁻¹ in PCR reactions (50 pmol per 50 μl reaction). Concentrations between 0.1 and 1 μmol l⁻¹ can be used. Higher concentrations may increase nonspecific annealing of primers and thus to nonspecific amplification products. PCR primers are normally between 18 and 30 nucleotides in length and should preferably have a guanine+cytosine (G+C) content of ∼50%. The temperature at which half the DNA molecules will be double-stranded, T_m, in degree celsius, for a primer is estimated by the rule-of-thumb equation: 2×(number of As and Ts)+4×number of Gs and Cs) (A=adenine, T=thymine). However, more accurate calculation of oligonucleotide T_m requires consideration of the effects of ionic strength and neighboring bases in the DNA strand (nearest neighbor T_m calculation methods). Software is available for performing these calculations. The T_m values for the two primers in a reaction should be similar, and the annealing temperature used is normally ∼5°C below the T_m. As annealing temperature approaches T_m, more specific amplifications are achieved, but overall yields may decrease. Despite careful calculations, empirical testing of annealing temperatures is essential for a well-optimized PCR assay. Complementarity at the 3′ ends of primer pairs should be avoided as this promotes the formation of primer oligomers (primer dimers). Such artifactual products are themselves templates for PCR amplification and compete with the desired products for deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), polymerase, and primers. This leads to a decreased yield of the desired product and the presence of nonspecific products that may complicate analysis.

A primer oligomer forms when two or more primers anneal to each other and are extended during PCR. The double-stranded product acts as a template during subsequent rounds of amplification and competes with the desired product. In general, low annealing temperatures, high enzyme concentrations, and high primer concentrations increase the probability of primer oligomerization. However, it is stringency during the initial cycle of PCR that is most critical for primer oligomer formation, as well as for nonspecific PCR products in general. Various techniques for maintaining high stringency up until the point when primers and enzyme are mixed together have been described (generally called Hot Start). Hot Start methods involve mixing of enzyme and primers only after reactions have reached a stringent temperature. A simple technique for Hot Start is manual addition of a small volume (typically 5–10 μl) of reaction buffer containing the enzyme to the other components maintained in the thermal cycler at ∼80°C, then continuing with standard PCR amplification. Another method involves sealing a portion of the amplification reaction under wax, then adding the remaining reactants above the wax barrier. Enzymatic methods to accomplish the same goal include the use of a modified DNA polymerase that is blocked with a thermolabile group or the use of uracil DNA glycosylase (uracil-N-glycosylase, UNG), deoxyuridine triphosphate (dUTP), and a brief initial incubation at 50°C. Typically, dUTP is substituted on an equimolar basis for deoxythymidine triphosphate (dTTP) (200 μmol l⁻¹), but higher concentrations of dUTP (125–300 μmol l⁻¹) may be beneficial in some assays. Uracil DNA glycosylase is used at 1–2 Units per reaction. This method ensures that any nonspecific product or primer oligomer that is generated during the initial low-stringency conditions will contain uracil (U) and therefore be susceptible to cleavage by UNG. Uracil is excised during the 50°C incubation, and strand breakage occurs at these abasic sites during the initial denaturation step. In addition to inactivating any contaminating amplicons, this method reduces nonspecific products and primer oligomer. Because residual UNG can degrade the U-containing amplicons, PCR products must be analyzed immediately or stored at 4°C for short periods of time or frozen for longer times. Alternately, UNG can be removed by extraction with organic solvents or digested with proteases.

The 3′ end of a PCR primer should be perfectly complementary to the template DNA. Failure of the 3′ end to hybridize results in inefficient amplification. Internal sequences are less critical. Provided a suitable annealing temperature is used, degenerate primers (primers that consist of a pool of different but closely related oligonucleotides) may be used to ensure that primers will anneal to highly variable sequences or sequences that are only partially known. These primers are designed from amino acid sequences or from a comparison of similar genes from other organisms. Sequences at the 5′ end of the primer are least critical. Providing the hybridizing portion of the primer is long enough to ensure annealing to the template DNA, nonhomologous 5′ extensions (regions that do not correspond to the sequence of the template) can be used to introduce restriction enzyme sites into PCR products to be cloned or to add other sequences such as phage RNA polymerase promoters.

Multiplex PCR enables the detection of multiple gene sequences within the same reaction. Because several sets of PCR primers must function in the same reaction without interference, primer design and optimization of reaction conditions are critical.

Primers are often labeled with detectable groups to facilitate post-PCR analysis. Radioactive isotopes, haptens such as biotin, or fluorescent dyes are the most widely used. Labels attached to the 5′ end of a primer have little or no effect on amplification.

Many heat-stable polymerases used for PCR exhibit a template-independent activity that adds deoxynucleosides (predominantly deoxyadenosine) to the 3′ ends of all double-stranded molecules in the reaction. These A-overhangs must be filled in prior to blunt-end cloning of PCR products. Alternatively, special vectors are available that have single 3′ T-overhangs at the cloning site ready for insertion of the PCR product. Choosing a polymerase without this activity or adjusting reaction conditions to either minimize or maximize the extent of A-overhangs may produce sharper peaks in high-resolution electrophoretic analysis.

Deoxynucleoside triphosphates

dNTPs are typically used at a concentration of ∼200 μmol l⁻¹ each dNTP in a PCR reaction. Excessively high concentrations promote nonspecific product formation. Modified dNTPs are sometimes used to label PCR products with radioactive or fluorescent markers or with haptens such as biotin, fluorescein, or digoxygenin. The modified dNTP is typically used at a concentration (0.1–1 μmol l⁻¹) much lower than the unmodified dNTP (∼200 μmol l⁻¹). Probes can be easily generated using PCR amplification with a labeled nucleotide, followed by removal of the unincorporated label.

Buffer components

Several reagents containing buffer ions, monovalent salts, and divalent cations required for polymerase activity, have been described for use in PCR amplification. The most widely used buffer consists of 10 mmol l⁻¹ Tris–HCl (pH 8.3 at room temperature) and 50 mmol l⁻¹ KCl. At the extension temperature (72°C), the pH of this Tris buffer falls to 7.2, near the optimum for Taq DNA polymerase. Sulfate-containing buffers such as 20 mmol l⁻¹ Tris–SO₄ (pH 8.5–9.0 at room temperature) and 20 mmol l⁻¹ (NH₄)₂SO₄ are also widely used. Monovalent cations (K⁺ or NH₄⁺) are included to adjust ionic strength. DNA polymerases require divalent cations for activity, and PCR reactions contain MgCl₂ (1–5 mmol l⁻¹). In general, higher MgCl₂ concentrations promote nonspecific primer annealing and nonspecific product amplification. Reaction buffers usually include a low percentage (0.1–0.5%) of nonionic detergent such as Igepal CA-630, Tween 20, or Triton X-100 to minimize adsorption of polymerase to the surfaces of the PCR tube. Proteins (gelatin or bovine serum albumin) are sometimes included at similar concentrations as nonionic detergents for the same reason. Other components that have been reported to increase PCR product yields or specificity on specific templates include betaine, dimethylsulfoxide, formamide, and glycerol.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B0123693977004751

Odorant Binding and Chemosensory Proteins

Jiao Zhu, … Paolo Pelosi, in Methods in Enzymology, 2020

7.1 Protocol

7.1.1 First PCR

Amplification of a segment of PxylGOBP2 by PCR.

Mixture	Temperature cycles
Water	34 μL	95 °C (3′)
5 × Buffer	10
10 mM dNPTs mix	2	95 °C (30″)
Template (pET30/PxylGOBP2)	1	50 °C (30″) 35 cycles
Primer forward 10 μM	1	72 °C (1′)
Primer reverse 10 μM	1
Pfu DNA polymerase (Promega)	1	72 °C (6′)
Total	50

7.1.2 Purification of the PCR product

The entire PCR product is loaded onto a 1% agarose gel and separated by electrophoresis. The amplified band is excised from the gel and purified using a commercial kit.

7.1.3 Second PCR

A second PCR is performed using fresh reagents and the purified double-strand DNA from the first PCR as a pair of primers. During this step, the whole plasmid is amplified.

Mixture	Temperature cycles
Water	2 μL	95 °C (30″) 9 cycles
5 × Buffer	4	68 °C (6′)
10 mM dNPTs mix	2
Template (pET30/PxylGOBP2)	1	68 °C (16′)
1st PCR product	10
Pfu DNA polymerase (Promega)	1
Total	20

7.1.4 Digestion with DpnI

As in Section 6.3.3.

7.1.5 Transformation of DH5α E. coli cells

As in Section 6.3.4.

7.1.6 Analysis of colonies

As in Section 6.3.5.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687920302366

Ribonucleases — Part B

Christian Heubeck, Astrid Schön, in Methods in Enzymology, 2001

B Enzymes and Cloning Procedures

All cloning procedures are performed as described⁸ and conform to the German Federal Law for Biological Safety; Escherichia coli DH5α, JM109, and SG 13009 are used throughout.

Restriction DNases and other enzymes used in cloning procedures are purchased from Roche Molecular Biochemicals (formerly Boehringer Mannheim) or New England BioLabs (Beverly, MA) if not stated otherwise. Tth and Pfu DNA polymerases used for polymerase chain reaction (PCR) are from Epicentre (Madison, WI) and Stratagene (La Jolla, CA), respectively. Sequences of all genetic constructs are determined either manually with the Sequenase 2.0 kit (Amersham-USB, Cleveland, OH) or automatically by an ABI-Prism sequencer (PE Biosystems, Foster City, CA). Factor Xa protease is from Roche Molecular Biochemicals. T7 RNA polymerase is prepared according to Zawadzki and Gross.⁹

Reagents. All reagents are of analytical or reagent grade and purchased from Roche Molecular Biochemicals (formerly Boehringer Mannheim), New England BioLabs, or Merck (Darmstadt, Germany) if not stated otherwise.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687901425407

DNA and Aspects of Molecular Biology

John D. Pickert, Benjamin L. Miller, in Comprehensive Natural Products Chemistry, 1999

7.18.4.3 The Polymerase

Another key component of the PCR reaction is the polymerase enzyme. There are many polymerases to choose from, each with its own advantages and disadvantages, so making a choice of polymerase is frequently a process of trial and error. Two of the most commonly used polymerases are Taq DNA polymerase and its variants, from the bacterium Thermus aquaticus,^97,98 and Pfu DNA polymerase from the marine archaebacterium Pyrococcus furiosus. As a consequence of their origins in thermophilic bacteria, both of these enzymes are stable at the high temperatures that are necessary for the denaturing step of the PCR reaction. An advantage of Taq DNA polymerase over Pfu is that Taq has a more than fivefold greater nucleotide incorporation rate than Pfu. On the other hand, the error rate for Taq polymerase is on the order of 10⁻⁵ (i.e., one misincorporated nucleotide per 10 000 bases),^99,100 while Pfu DNA polymerase has the lowest rate of misincorporation of nucleotides of all thermostable DNA polymerases, due to its 3′ to 5′ proof-reading ability.^101–105 Therefore, it is often advantageous to carry out the PCR in parallel with both enzymes. In addition, there are a number of variations of Taq DNA polymerase, identified here by their trade names. A few of these include AmplitaqGold,¹⁰⁶ TaqStart antibody, which blocks the polymerase activity during PCR setup so as to eliminate primer dimer formation and production of nonspecific products,¹⁰⁷ and LA Taq, used for long range amplification.

Other, nonthermostable DNA polymerase enzymes, such as E. coli DNA polymerase and Klenow fragment DNA polymerase, are not appropriate for the PCR, since thermal cycling causes them to lose activity relatively quickly. Both of these enzymes were used successfully for PCR prior to the discovery of the more stable thermophilic enzymes.¹⁰⁸ However, they can be useful in other contexts. A mixture of Taq and Pfu is also available from at least one manufacturer.¹⁰⁶ In principle, this combines the speed of Taq-based PCR reactions with the proof-reading ability of Pfu. This should be particularly useful for cloning large stretches of DNA (i.e., the manufacturer suggests that the Taq–Pfu mixture may be used for amplification of up to 35 kb).¹⁰⁹

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780080912837001594

Enzymology at the Membrane Interface: Intramembrane Proteases

B. Cordier, M.K. Lemberg, in Methods in Enzymology, 2017

3.3.1 Materials and Equipment

–: DNA template to PCR amplify the substrate’s TMD (cDNA, plasmid)
–: Forward and reverse primers: the forward primer includes the SP6 promoter, Kozak initiation sequence, ATG for initiation followed by coding region of interest. The reverse primer has to contain a TAG stop codon.
–: Pfu DNA polymerase or any other polymerase with proof reading activity
–: Phenol
–: Phenol/chloroform
–: Chloroform
–: Sodium acetate (NaOAc)
–: SP6 RNA polymerase
–: m7G(5′)ppp(5′)G RNA CAP structure analog (New England Biolabs, USA)
–: ATP, CTP, GTP, UTP
–: Spermidine
–: RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega, USA)
–: Magnesium acetate (Mg(OAc)₂)
–: Dithiothreitol (DTT)
–: Wheat germ extract (Promega, USA)
–: Potassium acetate (KOAc)
–: Amino acid mixture minus methionine
–: [³⁵S]-methionine
–: Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
–: Puromycin
–: EGTA (ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)
–: Vacuum gel dryer
–: Tris-Bicine gel system and buffers
–: Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare, United Kingdom)

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687916303184

Directed Evolution Tools in Bioproduct and Bioprocess Development

Sheryl B. Rubin-Pitel, … Huimin Zhao, in Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources, 2007

2.2.3 Random Chimeragenesis on Transient Templates (RACHITT)

In contrast to the above methods, RACHITT does not utilize thermocycling, strand switching, or staggered extension of primers [66]. Instead, a uracil-containing parent gene is made single-stranded to serve as a scaffold for the ordering of top-strand fragments of additional, homologous parent gene(s), and recombination occurs when fragments from different parent genes hybridize to the scaffold. Pfu DNA polymerase 3′-5′ exonuclease activity removes the unhybridized 5′ or 3′ overhanging “flaps” created by fragment annealing, and also fills gaps between the annealed fragments using the transient scaffold as a template. The template strand is then eliminated by treatment with uracil-DNA-glycosylase before applying the template-chimera hybrid to PCR, resulting in amplification of double stranded, homoduplex chimerical gene sequences. The process of RACHITT recombination is illustrated in Fig. 2. RACHITT provides a significantly higher rate of crossover compared to other family shuffling methods, with an average of 14 crossovers per gene versus one to four crossovers for most other methods. RACHITT also generates 100% chimerical progeny with no duplications of recombination pattern in chimerical genes. Although the benefits of this method are obvious, its use may be limited by its complexity and the requirement to create single stranded gene fragments as well as single stranded, uracil-DNA template.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780444521149500049

RNA Turnover in Eukaryotes: Analysis of Specialized and Quality Control RNA Decay Pathways

Thomas E. Mullen, … William F. Marzluff, in Methods in Enzymology, 2008

5.3 Polymerase chain reaction

Two rounds of PCR totaling 60 cycles are required for the detection of oligouridylated tails on the 3′ end of histone mRNA. This likely reflects the very low abundance of these degradation intermediates. Histone genes have a high guanine and cytosine content (roughly 67% on average), which can make amplifying full-length histone cDNA difficult. Therefore, for the first round of PCR, we use GC-rich Pfu DNA polymerase (Invitrogen) where we target specific histone mRNAs with an oligonucleotide targeting the 5′-UTR and the T7 reverse primer (Table 2.1). The nonallelic copies of each of the five classes of replication-dependent histone genes have ORFs that have little divergence at the nucleotide level and almost none at the protein level (Marzluff et al., 2002) so targeting individual genes of each class of histone mRNA requires targeting the 5′-UTR. For the first round, perform 30 cycles (95°C for 30 s, 50–54°C for 30 s, and 72°C for 30 s) in a 50-μl PCR reaction containing 0.5 μl GC-rich DNA polymerase, 10 μl of 5× buffer A supplied by the manufacturer (Invitrogen), 0.5 μl of each 5′-UTR oligonucleotide and T7 reverse, 1–2 μl of oligo(dA) RT, and 37.5 μl water. We did not observe any detectable amplicons in the first round of PCR using ethidium bromide staining. The second round of PCR uses oligonucleotides that target the ORF of the respective histone mRNAs and the same T7 reverse oligonucleotide (Table 2.1). Use 1 μl from the first round of PCR and identical cycling strategies (30 cycles) as in the first round. This time, however, Taq DNA polymerase, 5% dimethyl sulfoxide, and 10× Taq buffer (see earlier discussion) may be used in place of the GC-rich Pfu DNA polymerase. This will allow the option of T/A cloning the amplicons to confirm the position of the oligo(U) tails present on the 3′ end of histone mRNA following inhibition of DNA synthesis. Separate PCR products in 2% agarose gels containing ethidium bromide. Amplification of the histone H2a 3′ end using primer H2a/a O-1 (Table 2.1) generates a 188-bp product, whereas the H2a/a O-2 primer generates a product of 15 bp larger. Both the H3 genes targeted amplify a product approximately 200 bp (Fig. 2.5B). Common to the H3 oligo(dA), RT-PCR is a contaminating band of approximately 130 bp. This nonspecific band contains the 5′-UTR oligonucleotide, as well as the ORF oligonucleotide, followed by a small amount of the ORF sequence and then the T7 sequence. No nonencoded uridines are seen in clones of this nonspecific band, which is present in large amounts only when no oligo(U) tails on histone mRNA were detected.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687908024026

RNA Modification

Guowei Wu, … Yi-Tao Yu, in Methods in Enzymology, 2015

2.2.2 Protocol

1.

Purify pTRM4-WT plasmid using miniprep kit from Qiagen. Prepare the plasmid stock solution at 1 μg/μL, and dilute with ddH₂O to 10 ng/μL working concentration.

2.

Prepare DNA oligonucleotide primers with ddH₂O to 10 μM working concentration.

3.

Mix the following components in a 0.2-mL PCR tube:

5 μL	10 × Pfu DNA polymerase buffer
2 μL	10 mM dNTPs
2 μL	10 ng/μL pTRM4-WT plasmid
2 μL	10 μM TRM4-TAA-F1 primer
2 μL	10 μM TRM4-TAA-R1 primer
1 μL	5 U/μL Pfu DNA polymerase
Add ddH₂O to a final reaction volume of 50 μL.

4.

In a separate 0.2-mL PCR tube, prepare a control PCR with ddH₂O substituting the primers.

5.

Perform the PCR cycles as follows:

A: 95 °C for 2 min (1 cycle)

B: 95 °C for 30 s

55 °C for 1 min

68 °C for 9 min

(Repeat B for 28 cycles)

C: 72 °C for 2 min (1 cycle)

4 °C for indefinite time

6.

Take 10 μL of the PCR product and add 2 μL of 6 × DNA loading dye before loading the samples onto 1% agarose gel containing 0.05% (v/v) ethidium bromide.

7.

Carry out electrophoresis in 0.5 × TBE buffer for 30 min (at 10 V/cm gel length). Visualize the PCR products under UV light. The control PCR should have no visible bands.

8.

Once the successful amplification is confirmed, add 2 μL (10 U/μL) of DpnI (specific for methylated sites) to the PCR to linearize (remove) the wild-type plasmid template (pTRM4-WT) (the wild-type plasmid template is methylated, whereas the PCR product is not) and incubate at 37 °C for 2 h.

9.

Precipitate the PCR product by adding 200 μL of 100% ethanol and 5 μL of 3 M NaOAc, followed by centrifugation at the maximum speed (~ 14,000 × g) in a bench-top centrifuge for 10 min.

10.

Wash the pellet with 70% ethanol and air-dry. Carefully dissolve the PCR product in 10 μL of ddH₂O.

11.

Under sterile conditions, add 2 μL of PCR products to 100 μL of XL-blue competent cells (prealiquoted in 1.5-mL tube). Incubate on ice for 20 min.

12.

Heat shock the sample for 90 s at 42 °C and immediately return to ice for 2 min.

13.

Add 900 μL of autoclaved LB liquid medium to the sample and shake at 200 rpm for 1 h at 37 °C.

14.

Plate the sample onto a LB-ampicillin solid medium and incubate at 37 °C for 16 h.

15.

When colonies appear, pick 5–10 individual colonies and prepare plasmid DNA from each colony. Sequence the candidate plasmids using a proper primer. Choose one plasmid with correct sequence (codon TTT converted to TAA at F602 position) and label it as pTRM4-TAA. Adjust the concentration of the plasmid to 1 μg/μL.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915002359

Источник

Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules Part A

Milton H. Werner, … Takashi Nagata, in Methods in Enzymology, 2002

PCR Amplification of Tandemly Repeated Oligonucleotides

Reagents

Pfu DNA polymerase (ATCC 87496)

Whatman P11 phosphocellulose

Anion-exchange resin

Polyethyleneimine (Fluka)

(NH₄)₂SO₄ (ultrapure enzyme grade)

10 × Pfu PCR buffer: 200 mM Tris-HCl, pH 8.8, 100 mM KCl, 100 mM (NH₄)SO₄, 1.0% Triton X-100, 1.2 mg/ml bovine serum albumin (BSA)

100 mM MgSO₄

20 mM labeled dNTPs

Gel-purified oligonucleotide templates

EcoRV (Promega, Madison, WI)

Equipment

Thermal cycler (non-Peltier model preferred)

2.6 × 20 cm medium pressure chromatography column

2.5 × 10 cm Vydac 301 VHP DEAE HPLC column

Procedures

Table I. DNA Templates and Target Sequences for ULTRA^a

DNA template	Product sequence
ATCAGGATGCGGTTACTGATATCAGGATGCGGTTACTGATTAGTCCTACGCCAATGACTATAGTCCTACGCCAATGACTA 1	ATCAGGATGCGGTTACTGATTAGTCCTACGCCAATGACTA 2
ATCCAGAGGATGTGGCTTCTGATATCCAGAGGATGTGGCTTCTGAT TAGGTCTCCTACACCGAAGACTATAGGTCTCCTACACCGAAGACTA 3	ATCCAGAGGATGTGGCTTCTGAT TAGGTCTCCTACACCGAAGACTA 4
ATCGTTTGTCGATATCGTTTGTCGAT TAGCAAACAGCTATAGCAAACAGCTA 5	ATCGTTTGTCGAT TAGCAAACAGCTA 6

a: ULTRA: Uniform Labeling by Tandem Repeat Amplification. EcoRV restriction site is shown in boldface type, a half-site at each end and full site separating the tandem repeat of desired sequence.

Note: The choice of EcoRV here is essentially one of cost. Any restriction endonuclease may be used here depending on the properties of the ends that are desired.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687902382259

Marine Enzymes and Specialized Metabolism — Part A

Jingjing Yan, … Kui Hong, in Methods in Enzymology, 2018

4.2.3.3 Amplification of Au8003 and Au6298

1.

Design primer pairs of Au8003 and Au6298 according to the genomic sequence of strain 094102 (Table 5).

Table 5. Primers Used for Target Gene Cloning

Primer Name	Primer Sequence (5′–3′)
Au8003-F	CATATGATGGAGTATAAGTACTCGACC (NdeI)
Au8003-R	AAGCTTTCAAACCTTCAGCAGCTCCA (HindIII)
Au6298-F	CCCATATGATGTCTTCACCGCGTGCC (NdeI)
Au6298-R	CCAAGCTTTTATTTGGTGCGCTTGTAAA(HindIII)
Au13192-E1-S	GCGGCCGCATGCCACAAACACAATCC (NotI)
Au13192-E1-A	GCCGACTCGACAACATTATCATACAGAAACGCATACTCAAAGATATAACAAATAA
Au13192-E3-A	CATGAGCATGTCGACGAAG GGGGCGCCGGTATCGAT
Au13192-E4-S	CTTCGTCGACATGCTCATG
Au13192-E4-A	GCCGGGGCGAGGAGGATCTCGTCTCCTAGCTGCAC
Au13192-E5-S	ATCCTCCTCGCCCCGGC
Au13192-E5-A	AGTCTTCGATGTCGTCGAGCATGAGCGAGGCATTGTGTA
Au13192-E6-S	CTCGACGACATCGAAGACT
Au13192-E6-A	CTGCACCATCAACCTCGTAAGCAACCGGAACAACCCACCGGTCTTCTGCCTAACCATCTCCAAAT
Au13192-E8-S	TTACGAGGTTGATGGTGCAGATTGCGCCGGTGCGGCGGAAAGATCTCGACGGCATCTTATCAT
Au13192-E8-A	CCCTTTTGGCCGGTGTACTCTTCAGTTAGGTTCTTGTAGT
Au13192-E9-S	AGTACACCGGCCAAAAGGG
Au13192-E9-A	TCTAGATACACCTTCAACCTCTGCAC (Xba I)

2.

3.

4.

Verify PCR products by agarose gel electrophoresis (Fig. 8A and B).

Fig. 8

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687918301745

POLYMERASE CHAIN REACTION

J.M. WagesJr., in Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition), 2005

Biochemical Components

DNA polymerase

Oligonucleotide primers

Deoxynucleoside triphosphates

Buffer components

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B0123693977004751

Odorant Binding and Chemosensory Proteins

Jiao Zhu, … Paolo Pelosi, in Methods in Enzymology, 2020

7.1 Protocol

7.1.1 First PCR

Amplification of a segment of PxylGOBP2 by PCR.

Mixture	Temperature cycles
Water	34 μL	95 °C (3′)
5 × Buffer	10
10 mM dNPTs mix	2	95 °C (30″)
Template (pET30/PxylGOBP2)	1	50 °C (30″) 35 cycles
Primer forward 10 μM	1	72 °C (1′)
Primer reverse 10 μM	1
Pfu DNA polymerase (Promega)	1	72 °C (6′)
Total	50

7.1.2 Purification of the PCR product

The entire PCR product is loaded onto a 1% agarose gel and separated by electrophoresis. The amplified band is excised from the gel and purified using a commercial kit.

7.1.3 Second PCR

A second PCR is performed using fresh reagents and the purified double-strand DNA from the first PCR as a pair of primers. During this step, the whole plasmid is amplified.

Mixture	Temperature cycles
Water	2 μL	95 °C (30″) 9 cycles
5 × Buffer	4	68 °C (6′)
10 mM dNPTs mix	2
Template (pET30/PxylGOBP2)	1	68 °C (16′)
1st PCR product	10
Pfu DNA polymerase (Promega)	1
Total	20

7.1.4 Digestion with DpnI

As in Section 6.3.3.

7.1.5 Transformation of DH5α E. coli cells

As in Section 6.3.4.

7.1.6 Analysis of colonies

As in Section 6.3.5.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687920302366

Ribonucleases — Part B

Christian Heubeck, Astrid Schön, in Methods in Enzymology, 2001

B Enzymes and Cloning Procedures

All cloning procedures are performed as described⁸ and conform to the German Federal Law for Biological Safety; Escherichia coli DH5α, JM109, and SG 13009 are used throughout.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687901425407

DNA and Aspects of Molecular Biology

John D. Pickert, Benjamin L. Miller, in Comprehensive Natural Products Chemistry, 1999

7.18.4.3 The Polymerase

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780080912837001594

Enzymology at the Membrane Interface: Intramembrane Proteases

B. Cordier, M.K. Lemberg, in Methods in Enzymology, 2017

3.3.1 Materials and Equipment

–: DNA template to PCR amplify the substrate’s TMD (cDNA, plasmid)
–: Forward and reverse primers: the forward primer includes the SP6 promoter, Kozak initiation sequence, ATG for initiation followed by coding region of interest. The reverse primer has to contain a TAG stop codon.
–: Pfu DNA polymerase or any other polymerase with proof reading activity
–: Phenol
–: Phenol/chloroform
–: Chloroform
–: Sodium acetate (NaOAc)
–: SP6 RNA polymerase
–: m7G(5′)ppp(5′)G RNA CAP structure analog (New England Biolabs, USA)
–: ATP, CTP, GTP, UTP
–: Spermidine
–: RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega, USA)
–: Magnesium acetate (Mg(OAc)₂)
–: Dithiothreitol (DTT)
–: Wheat germ extract (Promega, USA)
–: Potassium acetate (KOAc)
–: Amino acid mixture minus methionine
–: [³⁵S]-methionine
–: Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
–: Puromycin
–: EGTA (ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)
–: Vacuum gel dryer
–: Tris-Bicine gel system and buffers
–: Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare, United Kingdom)

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687916303184

Directed Evolution Tools in Bioproduct and Bioprocess Development

Sheryl B. Rubin-Pitel, … Huimin Zhao, in Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources, 2007

2.2.3 Random Chimeragenesis on Transient Templates (RACHITT)

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780444521149500049

RNA Turnover in Eukaryotes: Analysis of Specialized and Quality Control RNA Decay Pathways

Thomas E. Mullen, … William F. Marzluff, in Methods in Enzymology, 2008

5.3 Polymerase chain reaction

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687908024026

RNA Modification

Guowei Wu, … Yi-Tao Yu, in Methods in Enzymology, 2015

2.2.2 Protocol

1.

Purify pTRM4-WT plasmid using miniprep kit from Qiagen. Prepare the plasmid stock solution at 1 μg/μL, and dilute with ddH₂O to 10 ng/μL working concentration.

2.

Prepare DNA oligonucleotide primers with ddH₂O to 10 μM working concentration.

3.

Mix the following components in a 0.2-mL PCR tube:

5 μL	10 × Pfu DNA polymerase buffer
2 μL	10 mM dNTPs
2 μL	10 ng/μL pTRM4-WT plasmid
2 μL	10 μM TRM4-TAA-F1 primer
2 μL	10 μM TRM4-TAA-R1 primer
1 μL	5 U/μL Pfu DNA polymerase
Add ddH₂O to a final reaction volume of 50 μL.

4.

In a separate 0.2-mL PCR tube, prepare a control PCR with ddH₂O substituting the primers.

5.

Perform the PCR cycles as follows:

A: 95 °C for 2 min (1 cycle)

B: 95 °C for 30 s

55 °C for 1 min

68 °C for 9 min

(Repeat B for 28 cycles)

C: 72 °C for 2 min (1 cycle)

4 °C for indefinite time

6.

Take 10 μL of the PCR product and add 2 μL of 6 × DNA loading dye before loading the samples onto 1% agarose gel containing 0.05% (v/v) ethidium bromide.

7.

Carry out electrophoresis in 0.5 × TBE buffer for 30 min (at 10 V/cm gel length). Visualize the PCR products under UV light. The control PCR should have no visible bands.

8.

9.

Precipitate the PCR product by adding 200 μL of 100% ethanol and 5 μL of 3 M NaOAc, followed by centrifugation at the maximum speed (~ 14,000 × g) in a bench-top centrifuge for 10 min.

10.

Wash the pellet with 70% ethanol and air-dry. Carefully dissolve the PCR product in 10 μL of ddH₂O.

11.

Under sterile conditions, add 2 μL of PCR products to 100 μL of XL-blue competent cells (prealiquoted in 1.5-mL tube). Incubate on ice for 20 min.

12.

Heat shock the sample for 90 s at 42 °C and immediately return to ice for 2 min.

13.

Add 900 μL of autoclaved LB liquid medium to the sample and shake at 200 rpm for 1 h at 37 °C.

14.

Plate the sample onto a LB-ampicillin solid medium and incubate at 37 °C for 16 h.

15.

Read full chapter

URL:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915002359

Источник

Процедура приготовления реакционной смеси

1 Все пробирки с растворами после оттаивания мягко потрясти и коротко отцентрифугировать .
2 Держать растворы в ледяной бане.
3 Смешать, в тонкостенной пробирке для ПЦР, находящейся в ледяной бане:

Вода стерильная деионизованная
ДНК-матрица
2.5mM dNTP смесь
Праймеры прямой и обратный
10X Pfu буфер
25mM MgCl2(при необходимости)
Раствор БСА
Pfu ДНК-полимераза

4 Мягко перемешать образец и коротко отцентрифугировать для сбора всех капель со стен пробирки.
5 Покрыть образец минеральным маслом (три четверти объема образца) либо подходящим количеством воска. Эта процедура может быть исключена, если амплификатор снабжен нагреваемой крышкой.
6 Поместить образцы в амплификатор, предварительно нагретый до 95°C и начать ПЦР.

Праймеры

Праймеры для ПЦР обычно длиной 20-30 нуклеотидов.
Праймер не должен быть самокомплементарным или комплементарным к любому другому праймеру находящемуся в реакционной смеси. Это предотвращает образование <праймер-димеров>.
3’=>5′ экзонуклеазная активность, ассоциированная с Pfu- ДНК-полимеразой может деградировать праймеры. Поэтому важно, чтобы Pfu- ДНК полимераза добавлялась в реакционную смесь последней. Деградация праймеров может быть эффективно предотвращена введением фосфоротиоатных связей на их 3′-конце (1).

Дезоксинуклеозидтрифосфаты

Производимые НПО СибЭнзим смеси dNTP представлены в концентрациях 0.5mM , 2.5mM , и 4 mM, удобных для прямого использования в ПЦР.

Pfu- ДНК полимераза

Рекомендуемая концентрация около 2.5 единиц / 50мкл.
Не используйте dUTP в пцр

Предотвращение упаривания реакционной смеси

При необходимости, реакционная смесь может быть покрыта (квалификация чистоты: <для использования в ПЦР>) парафином (с температурой плавления 50-60°C) либо минеральным маслом. Трех четвертей от общего объема реакционной смеси обычно достаточно.

Условия термоциклирования

Параметры амплификации сильно зависят от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.

Pfu- ДНК полимераза имеет меньшую процессивность, чем Taq , поэтому рекомендуемое время составляет 2 мин на каждую тысячу пар нуклеотидов амплифицируемого фрагмента.

Завершающая стадия синтеза

После последнего цикла, образцы обычно выдерживают при 72°C в течение 5-15 мин для заполнения выступающих 5 штрих концов ПЦР продуктов комплементарной цепью.
Pfu- ДНК полимераза, в отличие от Taq- ДНК полимеразы, не имеет активности терминальной трансферазы и производит ПЦР — продукты с тупыми концами.

Литература

1. Skerra, A., Phosphorothioate primers improve the amplification of DNA sequences by DNA polymerases with proofreading activity, Nucleic Acids Res., 20, 3551-3554, 1992.

Источник

Макеты страниц

Было установлено, что частота ошибок при репликации ДНК Е. coli не превышает 1 на нуклеотидов. Поскольку хромосома Е. coli содержит приблизительно пар оснований, на 10000 клеток, претерпевших один цикл деления, встраивается всего один неправильный нуклеотид.

Долгое время считалось, что столь высокая степень точности воспроизведения генетической информации целиком определяется точностью уотсон-криковского спаривания между матричной и новообразованной (дочерней) цепями, однако в результате последующего анализа выяснилось, что если бы точность репликации зависела исключительно от правильности спаривания оснований, то частота ошибок была бы значительно выше — приблизительно 1 на 104-105 остатков. Следовательно, чтобы объяснить такую низкую частоту ошибок при репликации in vivo, необходимо предположить участие в процессе репликации еще какого-то одного или нескольких факторов.

Более детальное изучение свойств высокоочищенных ДНК-полимераз позволило получить по крайней мере частичный ответ на вопрос о природе этих факторов. Напомним, что ДНК-полимеразы I и III обладают тремя различными ферментативными активностями. Мы уже видели, как фермент функционирует в качестве полимеразы, а также как он может удалять нуклеотидные остатки с 5-конца фрагмента ДНК. Однако 3-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз I и III очень озадачивала исследователей, ибо она означала, что эти ферменты способны «пятиться», отщепляя З-концевые нуклеотиды в направлении, противоположном тому, в котором они действуют как полимеразы. З-экзону-клеазная активность ДНК-полимераз I и III — это средство проверки новосинтезированной цепи ДНК и исправления ошибок, сделанных ферментом при его работе в качестве полимеразы. Если ДНК-полимераза встраивает неправильный нуклеотид, то фермент сам может распознать неспособность этого нуклеотида образовать правильную пару с соответствующим нуклеотидом матрицы (рис. 28-15). В этом случае фермент возвращается назад и отщепляет неправильный нуклеотид с З-конца цепи, после чего полимераза продолжает присоединять правильные нуклеотиды, т.е. возобновляет свое обычное продвижение в направлении

Рис. 28-15. Исправление ошибок с помощью 3-зкзонуклеазной активности ДНК-полимеразы.

Таким образом, по мере перемещения репликативной вилки вдоль матрицы осуществляется проверка каждого встроенного нуклеотида. Корректирующее действие ДНК-полимеразы очень эффективно; благодаря ему точность репликации повышается как минимум в 104 раз. Суммарная ошибка возникает в результате ошибок, допускаемых ферментом в ходе полимеризации и в процессе исправления их при корректировке; она не превышает одной ошибки на нуклеотидных остатков.

Очень важно отметить, что процесс репликации протекает со значительно более высокой степенью точности, чем процессы транскрипции и трансляции. Частые ошибки в репликации подвергли бы большому риску сохранность видов и их жизнеспособность.

Ошибки же в транскрипции и трансляции гораздо менее опасны, поскольку они влияют на образование РНК или белка только в одной клетке и не изменяют всю последующую родословную вида. Корректировка с помощью ДНК-полимеразы — это, вероятно, лишь один из путей, обеспечивающих высокую точность репликации. Возможно, исключительно сложная организация репликативного процесса и участие в нем множества белков необходимы для достижения именно этой цели. Интересно, что некоторые эукариотические ДНК-полимеразы не осуществляют корректировку. По-видимому, эукариоты обеспечивают точность и надежность процесса репликации с помощью каких-то других средств.

Источник

ДНК-полимераза Pfu — Pfu DNA polymerase

ДНК-полимераза Pfu

Идентификаторы

Организм

Pyrococcus furiosus

Символ

pol

PDB

4ahc

UniProt

P61875

Ищи
Структуры	Швейцарская модель
Домены	ИнтерПро

Pfu ДНК-полимераза фермент, обнаруженный в гипертермофильных Археон Pyrococcus furiosus, где он функционирует, чтобы скопировать организм ДНК во время деления клеток. В лабораторных условиях Pfu используется для усиления ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР), где фермент выполняет центральную функцию копирования новой цепи ДНК на каждом этапе удлинения.

Это семья B ДНК-полимераза. Имеет РНКаза H -подобный 3′-5′-экзонуклеазный домен, типичный для полимеразы B-семейства, такой как ДНК-полимераза II.^[1]

Pfu ДНК-полимераза обладает превосходной термостабильностью и свойствами корректуры по сравнению с Taq ДНК-полимераза. В отличие от Taq ДНК-полимераза, Pfu ДНК-полимераза имеет от 3 ‘до 5’ экзонуклеаза корректирующая деятельность, что означает, что по мере того, как ДНК собирается из 5 ‘конец к 3 ‘конец, активность экзонуклеазы немедленно удаляет нуклеотиды неправильно вставлен на 3’-конце растущей цепи ДНК. Как следствие, Pfu Фрагменты ПЦР, полученные ДНК-полимеразой, будут иметь меньше ошибок, чем Taq-генерированные вставки ПЦР.

В продаже Pfu обычно приводит к частоте ошибок 1 из 1,3 миллиона пар оснований и может давать 2,6% мутировавших продуктов при амплификации фрагментов размером 1 т.п.н. с помощью ПЦР. Тем не мение, Pfu работает медленнее и обычно требует 1-2 минуты на цикл для амплификации 1 килобайт ДНК при 72 ° C. С помощью Pfu ДНК-полимераза в реакциях ПЦР также приводит к образованию продуктов ПЦР с тупым концом.^[2]

Pfu Следовательно, ДНК-полимераза превосходит Taq ДНК-полимераза для методов, требующих синтеза ДНК с высокой точностью, но также может использоваться в сочетании с Taq полимеразы, чтобы получить точность Pfu со скоростью Taq полимеразная активность.^[3]

История

Ученые под руководством Эрика Матура из биотехнологической компании Stratagene, базирующейся в Ла-Хойя, Калифорния, открыли ДНК-полимеразу Pfu, которая демонстрирует значительно более высокую точность репликации, чем ДНК-полимераза Taq, в 1991 году.^[4] Они получили патенты на экзонуклеаз-дефицитные Pfu и полный Pfu в 1996 г.^[5]

Прочие полимеразы из Пирококк штаммы, такие как «Deep Vent» (Q51334) из штамма ГБ-Д и ДНК-полимераза Pwo также видел применение.^[3]

внешняя ссылка

Стратагена Pfu Патенты США
Патент 5,489,523
Патент 5,545,552

Источник

Реактивы для молекулярной биологии на каждый день: на складе по специальным ценам!

16.11.2020

Специальные цены на реактивы для молекулярной биологии Thermo Fisher Scientific со склада Диаэм в Москве! Буферы для ПЦР, ДНК-полимеразы, красители, рестриктазы, наборы GeneJET и многое другое — смотрите полный список товаров ниже.

Реактивы для ПЦР:

Thermo FS Дезоксинуклеотидтрифосфаты dATP, dCTP, dGTP, dTTP, смесь, 2 мМ каждого
R0242	5х1 мл	транспортировка -20°C	22 296, руб.
Смесь водных растворов дезоксинуклеотидтрифосфатов — дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, каждый в концентрации 2 мМ. Особенности: Чистота свыше 99%, подтверждена ВЭЖХ; не содержат ДНК человека и E.coli; стабильны в течение нескольких лет при -20^оС; стабильны после многих циклов замораживания-размораживания ; стабильны в течение нескольких недель при комнатной температуре и после 30 циклов ПЦР. Области применения: ПЦР фрагментов до 40 тыс. п.н.; синтез кДНК в реакции ОТ-ПЦР; ПЦР в реальном времени; высокоточная ПЦР; стандартная ПЦР. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Магния хлорид, раствор, 25 мМ
R0971	4х1.25 мл	транспортировка -20°C	5 208, руб.
Водный раствор хлорида магния, отфильтрованный через мембрану 0.22 мкм. Предназначен для оптимизации условий ПЦР. Совместим со всеми полимеразами Thermo Scientific -Taq, DreamTaq, Phusion и др. Также может использоваться в качестве ко-фактора в других ферментативных реакциях. Не содержит эндо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS ДНК-полимераза AmpliTaq, термостабильная, c буфером GeneAmp II, 5 ед/мкл
N8080161	250 единиц	транспортировка -20°C	69 838, руб.
ДНК-полимераза AmpiTaq — термостабильная рекомбинантная ДНК-полимераза. Представляет собой Taq ДНК-полимеразу, синтезируемую культурой клеток E.coli. Метод получения ДНК-полимеразы AmpliTaq и контроль качества обеспечивают постоянство характеристик полимеразы независимо от партиии, что даёт вопсроизводимость результатов ПЦР. ДНК-полимераза AmpliTaq стабильно активна в диапазоне температур от +55 до +75^оС, что даёт возможность ставить ПЦР с различными праймерами, не оптимизируя уловия реакции. Синтезирует фрагменты ДНК до 5 тыс п.н. с 3’-выступающим аденином. Комплектуется 10-кратным буфером для ПЦР GeneAmp II и раствором MgCl₂. Также возможна комплектация с буфером GeneAmp I. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS ДНК-полимераза AmpliTaq, термостабильная, c буфером GeneAmp I, 5 ед/мкл
N8080160	250 единиц	хранение -20°C	69 838, руб.
ДНК-полимераза AmpiTaq — термостабильная рекомбинантная ДНК-полимераза. Представляет собой Taq ДНК-полимеразу, синтезируемую культурой клеток E.coli. Метод получения ДНК-полимеразы AmpliTaq и контроль качества обеспечивают постоянство характеристик полимеразы независимо от партиии, что даёт вопсроизводимость результатов ПЦР. ДНК-полимераза AmpliTaq стабильно активна в диапазоне температур от +55 до +75^оС, что даёт возможность ставить ПЦР с различными праймерами, не оптимизируя уловия реакции. Синтезирует фрагменты ДНК до 5 тыс п.н. с 3’-выступающим аденином. Комплектуется 10-кратным буфером для ПЦР GeneAmp I. Также возможна комплектация с буфером GeneAmp II и раствором MgCl2. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Вода очищенная , для молекулярной биологии, без нуклеаз
R0581
R0581	4х1,25 мл	транспортировка +4°C	4 307, руб.
R0582	30 мл		8 883, руб.
Деионизованная вода, отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для молекулярной биологии. Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Thermo FS Буфер для ПЦР Taq, с сульфатом аммония, 10-кратный
B33	4х1,25 мл	хранение -20°C, транспортировка -20°C	3 789, руб.
Готовый к использованию 10-кратный буфер для ПЦР. Предназначен для Taq ДНК-полимераз (нативных и рекомбинантных). Также доступен в других составах и без детергентов. Состав 10-кратного буфера: • 750 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25°C); • 200 mM (NH₄)₂SO₄ ; • 0.1% (v/v) Твин 20. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Буфер для ПЦР Taq, с сульфатом аммония и 20 мМ MgCl₂, 10-кратный
B34	4х1,25 мл	хранение -20°C	3 792, руб.
Готовый к использованию 10-кратный буфер для ПЦР. Предназначен для Taq ДНК-полимераз (нативных и рекомбинантных). Также доступен в других составах и без детергентов. Состав 10-кратного буфера: • 750 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25°C); • 200 mM (NH₄)₂SO₄; • 0.1% (v/v) Tween 20; • 20 mM MgCl₂ Условия хранения: -20°C.

Thermo FS Буфер для ПЦР Taq, с KCl и 15 мМ MgCl₂, 10-кратный
B16	4х1,25 мл	транспортировка -20°C	3 206, руб.
Готовый к использованию 10-кратный буфер для ПЦР. Предназначен для Taq ДНК-полимераз (нативных и рекомбинантных). Также доступен в других составах и без детергентов. Состав 10-кратного буфера: • 100 мМ Tрис-HCl (pH 8.8 при +25°C) • 500 мМ KCl • 0.8% (об.) Nonidet P40 • 15 мМ MgCl₂ Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Буфер для ПЦР GeneAmp, 10-кратный
N8080129	6х1.5 мл	хранение -20°C	28 190, руб.
Буфер GeneAmp I предназначен для ПЦР с ДНК-полимеразой AmpliTaq. Содержит 15 мМ MgCl₂. Условия хранения: -15-25^оС

Thermo FS Буфер для ПЦР GeneAmp II, 10-кратный
N8080130	6х1.5 мл	хранение -20°C	43 283, руб.
Буфер GeneAmp II предназначен для ПЦР с ДНК-полимеразой AmpliTaq. Не содержит MgCl₂, раствор MgCl₂ входит в комплект в виде отдельного реагента. Условия хранения: -15-25^оС

Thermo FS ДНК-полимераза Taq, термостабильная, рекомбинантная, 5 ед/мкл
EP0402
EP0402	500 единиц	транспортировка -20°C	22 378, руб.
EP0405	5×500 единиц	хранение -20°C, транспортировка -20°C	73 606, руб.
EP0406	10×500 единиц	хранение -20°C	122 051, руб.
Taq ДНК-полимераза — термостабильная ДНК-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Фермент катализирует синтез ДНК в направлении 5’->3’, не обладает 3’->5’ экзонуклеазной активностью (корректирующей) и обладает низкой 5’->3’ экзонуклеазной активностью. Также обладает трансферазной активностью, что проявляется в способности присоединять дополнительный адениновый остаток к 3’-концу синтезированной цепи ДНК. Это удобно при ТА-клонировании. Время полужизни фермента при +95^оС — не менее 40 минут. Полимераза способна встраивать модифицированные нуклеотиды — биотинилированные или флуоресцентно-меченные. Taq ДНК-полимераза — идеальный инструмент для стандартной ПЦР на последовательностях до 5 тыс. п.н. Области применения: рутинная амплификация ДНК до 5 тыс. п.н.; высокопроизводительная ПЦР; мечение ДНК. Комплектуется двумя 10-кратными буферами для ПЦР — с KCl и (NH₄)₂SO₄, а также 25 мМ раствором MgCl₂. Точность Taq ДНК-полимеразы составляет 4.5 х 104, т.е. вероятность ошибки составляет 2.2 х 10-5 на 1 цикл. Для экспериментов с микрочипами рекомендуется использовать Taq-буфер без детергентов. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Буфер для ПЦР DreamTaq Green, 10-кратный , 10-кратный
B71	4х1,25 мл	хранение -20°C	4 776, руб.
Буфер DreamTaq Green – это 10-кратный буфер для ПЦР, оптимизированный для постановки реакции с ДНК-полимеразой DreamTaq или DreamTaq Hot Start. Буфер содержит MgCl₂ в концентрации 20 мМ, а также KCl и (NH₄)₂SO_₄в оптимальном соотношении, что обеспечивает специфичность отжига праймеров при различных концентрациях Mg^²+. В состав буфера входят утяжеляющий агент и два маркерных красителя для электрофореза – голубой (миграция в 1% агарозном геле на уровне 3-5 тыс. п.н.) и жёлтый (миграция в 1% агарозном геле на уровне 10 п.н.). Это позволяет наносить ПЦР-смеси на гель непосредственно после реакции, не добавляя дополнительных реагентов. Красители имеют максимумы поглощения 424 и 615 нм соответственно. Для приложений, требующих регистрации оптической плотности или флуоресценции ПЦР-продуктов, рекомендуется использовать бесцветный буфер DreamTaq или предварительно очищать ПЦР-продукт с помощью набора для очистки ДНК из реакционных смесей. Условия хранения – — 20 °С.

Thermo FS ДНК-полимераза Phusion, термостабильная, высокоточная, 2 ед/мкл
F530S
F530S	100 единиц	хранение -20°C, транспортировка -20°C	24 620, руб.
F530L	500 единиц	транспортировка -20°C	103 510, руб.
ДНК-полимераза Phusion является золотым стандартом для высокопроизводительной ПЦР. Частота ошибок у этой полимеразы – более чем в 50 раз ниже, чем у стандартной Taq ДНК-полимеразы и в 6 раз ниже, чем у Pfu. ДНК-полимераза Phusion – наилучший выбор для клонирования и других экспериментов, требующих высокой точности при синтезе ДНК. Этот фермент обеспечивает стабильный выход ПЦР-продукта и быстроту проведения амплификации даже в присутствии ингибиторов. ДНК-полимераза Phusion синтезирует фрагменты ДНК с тупыми концами. Также возможна комплектация с буфером Green, содержащим утяжеляющий агент и маркерные красители (для удобства электрофоретического анализа продуктов ПЦР) и мастер-миксы с ДНК-полимеразой Phusion – готовые 2-кратные реакционные смеси для ПЦР. Условия хранения — 20 °С. Особенности ДНК-полимеразы Phusion: высокая точность синтеза (в 52 раза выше по сравнению с Taq); более высокая скорость синтеза – 1 тыс. п.н. за 15-30 секунд; универсальность – практически не требуется оптимизация условий ПЦР; больший выход ПЦР-продукта при минимальном количестве фермента. Области применения: высокоточная ПЦР; клонирование; синтез ДНК для секвенирования; амплификация сложных (GC-богатых) последовательностей; ПЦР длинных фрагментов (до 20 тыс. п.н.); сайт-специфический мутагенез; высокопроизводительная ПЦР; получение микрочипов. В состав набора входят: ДНК-полимераза Phusion (2 Ед/мкл); 5Х буфер Phusion HF; 5Х буфер Phusion GC; ДМСО; 50 мМ MgCl_₂. * в состав 5Х буферов Phusion уже входит 7,55 мМ MgCl_₂.

Thermo FS ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start Green, термостабильная, с «горячим» стартом, 5 ед/мкл
EP1711
EP1711	200 единиц	хранение -30…-5°C	19 893, руб.
EP1712	500 единиц	хранение -30…-5°C, транспортировка сухой лед	42 398, руб.
EP1713	2500 единиц	хранение -20°C	177 422, руб.
EP1714	4х2500 единиц	хранение -20°C	649 834, руб.
Термостабильная ДНК-полимераза с горячим стартом DreamTaq Hot Start Green представляет собой модифицированную Taq ДНК-полимеразу с улучшенными свойствами – повышенной специфичностью и производительностью. Функция горячего старта реализована с помощью ингибирования активности фермента антителами при комнатной температуре. Это препятствует образованию неспецифических продуктов до начала амплификации. Полимераза поставляется в комплекте с оптимизированным 10-кратным буфером DreamTaq Green, содержащим MgCl₂, а также утяжеляющий агент и маркерные красители (для удобства электрофоретического анализа продуктов ПЦР). Маркерные красители инертны, не взаимодействуют с компонентами ПЦР-смеси и не препятствуют использованию ПЦР-продуктов в реакциях рестрикции или лигирования, а также секвенированию. Если предполагается анализ ПЦР-продуктов с помощью спектрофотометрии или флуориметрии, рекомендуется использовать для амплификации бесцветный буфер DreamTaq или предварительно очищать ПЦР-продукт с помощью набора для очистки ДНК из реакционных смесей. Также предлагается формат в виде 2-кратной готовой смеси для ПЦР – мастер-микс DreamTaq Hot Start Green. ДНК-полимераза DreamTaq синтезирует фрагменты ДНК с аденозиновым остатком на 3’-концах, что делает их пригодными для ТА-клонирования. ДНК-полимераза DreamTaq способна амплифицировать фрагменты ДНК до 6 тыс. п.н. Не рекомендуется для амплификации GC-богатых последовательностей. Особенности ДНК-полимеразы DreamTaq Hot Start Green: более высокий выход ПЦР-продукта при меньших исходных концентрациях матрицы; повышенная специфичность и возможность подготовки реакционных смесей при комнатной температуре благодаря технологии горячего старта; способность синтеза более длинных ампликонов – до 6 тыс. пар нуклеотидов; требуется минимальная оптимизация условий отжига праймера и концентрации Mg^²+ благодаря улучшенному реакционному буферу; возможность нанесения ПЦР-продуктов на гель без добавления дополнительных реагентов для электрофореза. Области применения ДНК-полимеразы DreamTaq Hot Start Green: рутинная ПЦР; синтез фрагментов для ТА-клонирования; скрининг рекомбинантных клонов; обратная транскрипция с последующей ПЦР; генотипирование. В набор входят: 200 единиц: v ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start – 40 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq Green (с 20 мМ MgCl₂) – 1,25 мл. 500 единиц: v ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start – 100 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq Green (с 20 мМ MgCl₂) – 2 × 1,25 мл. 2500 единиц: v ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start – 5 × 100 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq Green (с 20 мМ MgCl₂) –10 × 1,25 мл. 4 × 2500 единиц, 4 упаковки, каждая содержит: v ДНК-полимеразу DreamTaq Hot Start – 5 × 100 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq Green (с 20 мМ MgCl₂) – 10 × 1,25 мл. Условия хранения – от — 5 °С до — 30 °С.

Thermo FS ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start, термостабильная, с «горячим» стартом, 5 ед/мкл
EP1701
EP1701	200 единиц	хранение -30…-5°C, транспортировка -30…-5°C	27 071, руб.
EP1702	500 единиц	хранение -20°C, транспортировка -20°C	42 398, руб.
EP1703	2500 единиц	хранение -30…-5°C	177 422, руб.
EP1704	4х2500 единиц	хранение -30…-5°C	651 463, руб.
Термостабильная ДНК-полимераза с горячим стартом DreamTaq Hot Start представляет собой модифицированную Taq ДНК-полимеразу с улучшенными свойствами – повышенной специфичностью и производительностью. Функция горячего старта реализована с помощью ингибирования активности фермента антителами при комнатной температуре. Это препятствует образованию неспецифических продуктов до начала амплификации. Полимераза поставляется в комплекте с оптимизированным 10-кратным буфером DreamTaq, содержащим MgCl₂. Также возможна комплектация с буфером Dream Taq Green, содержащим утяжеляющий агент и маркерные красители (для удобства электрофоретического анализа продуктов ПЦР) или 2-кратный мастер-микс (готовая смесь для ПЦР) на основе полимеразы DreamTaq Hot Start. ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start синтезирует фрагменты ДНК с аденозиновым остатком на 3’-концах, что делает их пригодными для ТА-клонирования. ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start способна амплифицировать фрагменты ДНК до 6 тыс. п.н. Не рекомендуется для амплификации GC-богатых последовательностей. Особенности ДНК-полимеразы DreamTaq Hot Start: более высокий выход ПЦР-продукта при меньших исходных концентрациях матрицы; повышенная специфичность и возможность подготовки реакционных смесей при комнатной температуре благодаря технологии горячего старта; способность синтеза более длинных ампликонов – до 6 тыс. пар нуклеотидов; требуется минимальная оптимизация условий отжига праймера и концентрации Mg^²+ благодаря улучшенному реакционному буферу. Области применения ДНК-полимеразы DreamTaq Hot Start: рутинная ПЦР; синтез фрагментов для ТА-клонирования; скрининг рекомбинантных клонов; обратная транскрипция с последующей ПЦР; генотипирование. В состав набора входят: 200 единиц: v ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start – 40 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq (с 20 мМ MgCl₂) – 1,25 мл. 500 единиц: v ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start – 100 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq (с 20 мМ MgCl₂) – 2 × 1,25 мл. 2500 единиц: v ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start – 5 × 100 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq (с 20 мМ MgCl₂) –10 × 1,25 мл. 4 × 2500 единиц, 4 упаковки, каждая содержит: v ДНК-полимеразу DreamTaq Hot Start – 5 × 100 мкл (5 Ед/мкл); v 10Х буфер DreamTaq (с 20 мМ MgCl₂) –10 × 1,25 мл. Условия хранения – от — 5 °С до — 30 °С.

Thermo FS Дезоксинуклеотидтрифосфаты dATP, dCTP, dGTP, dTTP, смесь, 10мМ каждого
R0191
R0191	0,2 мл	хранение -20°C	5 926, руб.
R0192	1 мл	транспортировка -20°C	20 514, руб.
R0193	5х1 мл	транспортировка -20°C	87 978, руб.
Водные растворы дезоксинуклеотидтрифосфатов дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, смешанные в одной пробирке в концентрации 10 мМ. Нуклеотиды имеют чистоту 99% и тестированы на отсутствие нуклеазной активности и примесей ДНК. Смесь удобна тем, что снижает число пипетирований при приготовлении реакционных смесей и предназначена для большинства молекулярно-биологических экспериментов. Нуклеотиды в составе смеси сохраняют свою стабильность при многократном замораживании-размораживании и при хранении при комнатной температуре до 7 недель. Условия хранения -20^оС

Thermo FS Дезоксинуклеотидтрифосфаты dATP, dCTP, dGTP, dTTP, набор, 4х100 мМ
R0181
R0181	4х0,25 мл	транспортировка -20°C	27 230, руб.
R0182	4х1 мл	транспортировка -20°C	95 774, руб.
Набор состоит из 4 пробирок, каждая из которых содержит 100-мМ водный раствор одного из дезоксинуклеотидтрифосфатов — дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ. Растворы титрованы NaOH до рН 7.3 — 7.5. Нуклеотиды имеют чистоту 99% и тестированы на отсутствие нуклеазной активности и примесей ДНК. Сохраняют стабильность при многократном замораживании-оттаивании. Набор предназначен для большинства молекулярно-биологических применений: стандартной ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, обратной транскрипции, мечения и секвенирования ДНК. Условия хранения -20^оС

Реактивы для обратной транскрипции:

Thermo FS Реагент для стабилизации РНК и хранения образцов RNAlater (аналоги арт. 3787.0100, 3787.0250, Диаэм)
AM7022
AM7022	50×1,5 мл		82 449, руб.
AM7023	20×5 мл		88 206, руб.
AM7020	100 мл		38 174, руб.
AM7024	250 мл		82 436, руб.
AM7021	500 мл		138 061, руб.
Раствор RNAlater для стабилизации РНК в интактных, размороженных образцах тканей, устраняет необходимость немедленной обработки или замораживания образцов в жидком азоте для последующей обработки. Особенности реагента RNAlater Реагент RNAlater имеет следующие особенности: не требует заморозки тканей перед консервацией; сохраняет количественный и качественный состав РНК; сохраняет РНК 1 сутки при температуре 37°C, 1 неделю при комнатной температуре, 1 месяц при 4°C, либо любой срок при -20°C; совместим с любыми процедурами выделения РНК; тестирован на широком спектре тканей различных организмов; заполняет полости и органы многоклеточных организмов для инактивации РНКаз и стабилизации РНК по всему объёму ткани; требуется небольшой объём реагента для стабилизации РНК в образце; позволяет собирать образцы тканей в местах, где немедленная изоляция РНК невозможна; для последующего выделения РНК из образца не требуется отмывать реагент. Условия хранения и перевозки — комнатная температура.

Thermo FS Транскриптаза обратная RevertAid, 200 ед/мкл.
EP0441
EP0441	10 000 единиц	транспортировка -20°C	16 186, руб.
EP0442	5х10 000 единиц	транспортировка -20°C	60 336, руб.
Обратная транскриптаза RevertAid — это рекомбинантная обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (M-MuLV) с модифицированной структурой и каталитическими свойствами. Фермент обладает РНК-зависимой и ДНК-зависимой полимеразной активностью. Обратная транскриптаза RevertAid проявляет активность РНКазы Н в меньшей степени, чем обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц (AMV-RT). Особенности обратной транскриптазы RevertAid Обратная транскриптаза RevertAid имеет следующие особенности: cинтезирует первую цепь кДНК до 13 тыс п.н.; оптимальная температура реакции +42 °С; активна до +50 °С; способна встраивать модифицированные нуклеотиды — меченые Су3, Су5, родамином родамином или флюоресцеином. Области применения обратной транскриптазы RevertAid Обратная транскриптаза RevertAid применяется в следующих областях: синтез первой цепи кДНК в реакциях ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени; синтез кДНК для клонирования или экспрессии белков; мечение ДНК для микрочипов; анализ РНК с помощью праймер-экстеншн. Комплектуется 5-кратным реакционным буфером. Условия хранения: -20 °С.

Thermo FS Набор для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой RevertAid H minus
K1632	100 реакций	транспортировка -20°C	87 142, руб.
Набор с обратной транскриптазой RevertAid — полная система для эффективного синтеза первой цепи кДНК ан РНК-матрицах. В состав набора входит обратная рестриктаза RevertAid — рекомбинантная обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (M-MuLV-RT). Она активна при температурах от +42 до +50оС и способна синтезировать кДНК до 13 тыс. п.н. В состав набора также входят: реакционный буфер, смесь дезокситрифосфатов, ингибитор РНКаз RiboLock, случайный 6-нуклеотидный праймер, олиго(дТ)18 праймер и контольный препарат — праймеры и матрица GAPDH. Олиго(дТ)18 праймер предназначен для специфического отжига на 3’-поли(А) матричной РНК. Для обратной транскрипции 5-концов РНК и РНК без поли(А)-концов используется случайный праймер. Также возможно использование ген-специфичных праймеров. Первая цепь кДНК может быть использована как матрица в ПЦР, ПЦР в реальном времени или для синтеза второй цепи кДНК. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Набор для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой RevertAid
K1622	100 реакций	хранение -20°C, транспортировка -20°C	60 725, руб.
Набор с обратной транскриптазой RevertAid — полная система для эффективного синтеза первой цепи кДНК ан РНК-матрицах. В состав набора входит обратная рестриктаза RevertAid — рекомбинантная обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (M-MuLV-RT). Она активна при температурах от +42 до +50оС и способна синтезировать кДНК до 13 тыс. п.н. В состав набора также входят: реакционный буфер, смесь дезокситрифосфатов, ингибитор РНКаз RiboLock, случайный 6-нуклеотидный праймер, олиго(дТ)18 праймер и контольный препарат — праймеры и матрица GAPDH. Олиго(дТ)₁₈ праймер предназначен для специфического отжига на 3’-поли(А) матричной РНК. Для обратной транскрипции 5-концов РНК и РНК без поли(А)-концов используется случайный праймер. Области применения: Синтез первой цепи кДНК в реакциях ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени; синтез полноразмерных библиотек кДНК; синтез антисмысловой РНК. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Ингибитор РНКаз Ribolock, 40 ед/мкл (аналоги арт. 3784.2000, арт. 3784.10000, Диаэм)
EO0382	4х2500 единиц	транспортировка -20°C	54 657, руб.
Ингибитор RiboLock ингибирует активность РНКаз А, В и С по неконкурентному механизму в соотношении 1 : 1. Не ингибирует эукариотические РНКазы T1, T2, U1, U2, CL3 и прокариотические РНКазы H и I. Работает в большинстве реакционных смесей и защищает РНК от деградации при температурах до +55^оС. Рекомендуемая рабочая концентрация — 1 ед/мкл. В состав буфера для хранения входит ДТТ, который обеспечивает стабильность ингибитора, но не является необходимым компонентом реакционной смеси. Области применения: Предохранение РНК от деградации при транскрипции и трансляции in vitro, обратной транскрипции, амплификации РНК, выделении мРНК-протеинового комплекса из клеток млекопитающих; выделение и хранение РНК; исследование специфической РНКазной активности. Условия хранения: -20^оС

Модификация и клонирование ДНК:

FD0374

50 реакций

13 151, руб.

Эндонуклеаза рестрикции Eco81I Fast Digest распознает и гидролизует сайты CC↓TNAGG при 37 °C за 5–15 минут в универсальном буфере FastDigest.

Эндонуклеаза рестрикции Eco81I Fast Digest относится к продвинутой линии ферментов для быстрого гидролиза ДНК, которые имеют 100% активность в универсальных реакционных буферах FastDigest и FastDigest Green.

Универсальные буферы FastDigest и FastDigest Green обеспечивают быстрый однократный, двойной или многократный гидролиз ДНК в течение 5-15 минут, исключая необходимость замены буфера или стадий очистки ДНК.

Короткое время инкубации и оптимальный состав универсального буфера позволяют устранить звездчатую активность.

ДНК/РНК модифицирующие ферменты, такие как фрагмент Кленова, T4 ДНК лигаза, щелочная фосфатаза и T4 ДНК полимераза обладают 100% активностью в буфере FastDigest. Следовательно, ферменты для последующих применений могут быть добавлены непосредственно в реакционную смесь.

Для дополнительного удобства универсальный буфер FastDigest Green включает реагент плотности и два трекинговых красителя для прямой загрузки продуктов реакции гидролиза на гель.

Сайт узнавания	5’ CC↓TNA GG 3’
3’ GG ANT↑CC 5’
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — не чувствителен.
Температурная инактивация	за 10 минут при 80°С
Поставляется в комплекте	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Изошизомеры	Bsu36I, AxyI, Bse21I
Хранение	-20 °С

Примечание: список всех эндонуклеаз рестрикции FastDigest, активность ферментов, время инкубации и инактивации при нагревании см. в таблице «Реакционные условия для эндонуклеаз рестрикции FastDigest, Thermo FS, таблица, 2021г».

FD0694

400 реакций

9 745, руб.

Эндонуклеаза рестрикции XhoI Fast Digest распознает и гидролизует сайты R↓AATTY при 37 °C за 5–15 минут в универсальном буфере FastDigest.

Эндонуклеаза рестрикции XhoI Fast Digest относится к продвинутой линии ферментов для быстрого гидролиза ДНК, которые имеют 100% активность в универсальных реакционных буферах FastDigest и FastDigest Green.

Сайт узнавания	5’ C↓TCGA G 3’
3’ G AGCT↑C 5’
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — чувствителен.
Температурная инактивация	5 минут при 80 °С
Поставляется в комплекте	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Хранение	-20 °С

FD0644

200 реакций

11 468, руб.

Эндонуклеаза рестрикции SalI Fast Digest распознает и гидролизует сайты G↓TCGAC при 37 °C за 5-15 минут в универсальном буфере FastDigest.

Эндонуклеаза рестрикции SalI Fast Digest относится к продвинутой линии ферментов для быстрого гидролиза ДНК, которые имеют 100% активность в универсальных реакционных буферах FastDigest и FastDigest Green.

Сайт узнавания	5’ G↓TCGA C 3’
3’ C AGCT↑G 5’
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — чувствителен.
Температурная инактивация	10 минут при 65 °С
Поставляется в комплекте	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Хранение	-20 °С

FD0596

250 реакций

57 037, руб.

Эндонуклеаза рестрикции NotI Fast Digest распознает и гидролизует сайты GC↓GGCCGC при 37 °C за 5–15 минут в универсальном буфере FastDigest.

Эндонуклеаза рестрикции NotI Fast Digest относится к продвинутой линии ферментов для быстрого гидролиза ДНК, которые имеют 100% активность в универсальных реакционных буферах FastDigest и FastDigest Green.

ДНК/РНК модифицирующие ферменты, такие как фрагмент Кленова, T4 ДНК лигаза, щелочная фосфатаза и T4 ДНК полимераза обладают 100% активностью в буфере FastDigest. Следовательно, ферменты для последующих применений могут быть добавлены непосредственно в реакционную смесь.

Сайт узнавания	5’ GC↓GGCC GC 3’
3’ GC CCGG↑CG 5’
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — чувствителен.
Температурная инактивация	5 минут при 80 °С
Поставляется в комплекте	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Изошизомеры	CciNI
Хранение	-20 °С

Примечание: cписок всех эндонуклеаз рестрикции FastDigest, активность ферментов, время инкубации и инактивации при нагревании см. в таблице «Реакционные условия для эндонуклеаз рестрикции FastDigest, Thermo FS, таблица, 2021г».

FD0974

100 реакций

12 587, руб.

Эндонуклеаза рестрикции NheI Fast Digest распознает и гидролизует сайты G↓CTAGC при 37 °C за 5–15 минут в универсальном буфере FastDigest.

Эндонуклеаза рестрикции NheI Fast Digest относится к продвинутой линии ферментов для быстрого гидролиза ДНК, которые имеют 100% активность в универсальных реакционных буферах FastDigest и FastDigest Green.

Сайт узнавания	5’ G↓CTAG C 3’
3’ C GATC↑G 5’
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — чувствителен.
Температурная инактивация	5 минут при 65 °С
Поставляется в комплекте	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Изошизомеры	AsuNHI, BmtI
Хранение	-20 °С

FD0574

100 реакций

15 533, руб.

Эндонуклеаза рестрикции NcoI Fast Digest распознает и гидролизует сайты C↓CATGG при 37 °C за 5–15 минут в универсальном буфере FastDigest.

Эндонуклеаза рестрикции NcoI Fast Digest относится к продвинутой линии ферментов для быстрого гидролиза ДНК, которые имеют 100% активность в универсальных реакционных буферах FastDigest и FastDigest Green.

Сайт узнавания	5’ C↓CATG G 3’
3’ G GTAC↑C 5’
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — не чувствителен.
Температурная инактивация	Нет
Поставляется в комплекте	буфер 10x FastDigest, буфер 10x FastDigest Green
Изошизомеры	Bsp19I
Хранение	-20 °С

Примечание: cписок всех эндонуклеаз рестрикции FastDigest, активность ферментов, время инкубации и инактивации при нагревании см. в таблице «Реакционные условия для эндонуклеаз рестрикции FastDigest, Thermo FS, таблица, 2021г».

ER0681

1500 а.е.

6 524, руб.

Сайт узнавания	5′ T↓CTAG A 3′
3′ A GATC↑T 5′
Концентрация	10 е.а./мкл
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер Tango
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — не чувствителен.
Инактивация за 20 минут при	65 °С
Поставляется в комплекте	10x буфер Tango
Условия хранения	-20 °С

Примечание: полный перечень эндонуклеаз рестрикции Thermo FS смотрите в таблице:

Эндонуклеазы рестрикции, Thermo FS, таблица, рус, 5 стр.

ER0501

5000 единиц

5 863, руб.

Сайт узнавания	5′ A↓AGCT T 3′
3′ T TCGA↑A 5′
Концентрация	10 е.а./мкл
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер R (Red)
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — не чувствителен.
Инактивация за 20 минут при	80 °С
Поставляется в комплекте	10x буфер R (Red); 10x буфер Tango
Условия хранения	-20 °С

Примечание: полный перечень эндонуклеаз рестрикции Thermo FS смотрите в таблице:

Эндонуклеазы рестрикции, Thermo FS, таблица, рус, 5 стр.

ER0271

5000 единиц

6 958, руб.

Сайт узнавания	5′ G↓AATTC 3′
3′ CTTAA↑G 5′
Концентрация	10 е.а./мкл
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер EcoRI
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — чувствителен.
Инактивация за 20 минут при	65 °С
Поставляется в комплекте	10x буфер EcoRI; 10x буфер Tango
Условия хранения	-20 °С

Примечание: полный перечень эндонуклеаз рестрикции Thermo FS смотрите в таблице:

Эндонуклеазы рестрикции, Thermo FS, таблица, рус, 5 стр.

ER0051

4000 единиц

хранение -20°C, транспортировка -20°C

4 714, руб.

Сайт узнавания	5′ G↓GATC C 3′
3′ C CTAG↑G 5′
Концентрация	10 е.а./мкл
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер BamHI
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование — не чувствителен; CpG метилирование — не чувствителен.
Инактивация за 20 минут при	80 °С
Поставляется в комплекте	10x буфер BamHI; 10x буфер Tango
Условия хранения	-20 °С

Примечание: полный перечень эндонуклеаз рестрикции Thermo FS смотрите в таблице:

Эндонуклеазы рестрикции, Thermo FS, таблица, рус, 5 стр.

ER0592

1500 единиц

39 984, руб.

Сайт узнавания	5′ GC↓GGCCGC 3′
3′ CGCCGG↑CG 5′
Концентрация	10 е.а./мкл
Оптимальная реакционная температура	37 °С
Оптимальный реакционный буфер	буфер O (Orange)
Чувствительность к метилированию	dam метилирование — не чувствителен; dcm метилирование – не чувствителен; CpG метилирование — чувствителен.
Инактивация за 20 минут при	80 °С
Поставляется в комплекте	10x буфер O (Orange); 10x буфер Tango
Условия хранения	-20 °С

Примечание: полный перечень эндонуклеаз рестрикции Thermo FS смотрите в таблице:

Эндонуклеазы рестрикции, Thermo FS, таблица, рус, 5 стр.

EN0581

4000 единиц

20 352, руб.

Экзонуклеаза ExoI специфически расщепляет одноцепочечную ДНК в направлении 3′—> 5′, высвобождая дезоксинуклеотид-монофосфат.

Не расщепляет цепи ДНК, 3’-конец которых блокирован фосфорильной или ацетильной группой.

Активна в ПЦР-буфере.

Области применения:

Удаление праймеров из ПЦР-смесей, в том числе перед секвенированием;
расщепление 1-цепочечной ДНК с 3’-гидроксилированными концами.

Важно! фермент не предназначен для отщепления липких 3’-концов у 2-цепочечной ДНК.

Условия хранения: -20^оС

EF0654

300 единиц

8 099, руб.

EF0651

1000 единиц

хранение -20°C, транспортировка -20°C

16 153, руб.

EF0652

5000 единиц

63 761, руб.

Щелочная фосфатаза катализирует отщепление 5’- и 3’-фосфатных групп от ДНК, РНК и нуклеотидов, а также от белков.

Термочувствительная фосфатаза FastAp активна во всех рестриктазных и ПЦР-буферах. Она дефосфорилирует все типы концов ДНК (липкие и тупые) в течение 10 минут при +37^оС и инактивируется при +75^оС в течение 5 минут, поэтому не требуется очистка реакционной смеси перед лигированием.

Особенности щелочной фосфатазы FastAp:

Рекомбинантный белок;
быстрое дефосфорилирование — 10 минут;
быстрая инактивация — 5 минут;
можно использовать для одновременного расщепления и дефосфорилирования векторной ДНК;
активна во всех рестриктазных и ПЦР-буферах;
дефосфорилирует белки;
используется для очистки ПЦР-смесей совместно с ExoI.

Области применения:

Дефосфорилирование векторной ДНК при клонировании;
очистка ПЦР-продуктов из реакционных смесей перед секвенированием;
дефосфорилировнание 5’-концов ДНК перед мечением полинуклеотидкиназой Т4;
другие экперименты, связанные с дефосфорилированием нуклеиновых кислот;
дефосфорилирование белков.

Важно!

Связывание фосфатазы с ДНК може приводить к смещению полос в агарозном геле. Во избежание подобного смещения рекомендуется добавлять к электрофорезным образцам буфер для нанесения с SDS и инкубировать образцы в течение 10 минут при +65^оС, а затем охладить во льду.

Условия хранения: -20^оС

R0441

0.25 мл

13 986, руб.

АТФ (аденозин-5’-трифосфат) — высоко стабильный нуклеотид. Предлагается в виде водного 100 мМ раствора, титрованного NaOH до рН 7.3-7.5. Чистота не менее 99%. Стабилен при -20 °С в течение нескольких лет, выдерживает многократное замораживание-оттаивание.

Области применения аденозина-5’-трифосфата

Аденозин-5’-трифосфат применяется в следующих областях:

транскрипция in vitro;
синтез РНК, в том числе микроРНК;
лигирование;
фосфорилирование.

Условия хранения: -20 °С.

R0392

5 г

21 582, руб.

R0393

5×5 г

71 756, руб.

ИПТГ (Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) — высокостабильный аналог лактозы. Он инактивирует lac-репрессор и индуцирует синтез бета-галактозидазы, фермента, метаболизирующего лактозу. Используется как индуктор экспрессии генов, клонированных под контроль lac-оперона.

Также используется совместно с X-Gal для бело-голубой селекции клонов.

Рекомендуется приготовление стокового раствора в концентрации 100 мМ. Для бело-голубой селекции используется конечная концентрация 0.1 мМ.

Условия хранения: +4^оС

EP0062

500 единиц

39 951, руб.

EP0061

100 единиц

10 028, руб.

K1231

20 реакций

30 331, руб.

K1232

40 реакций

57 566, руб.

Современные ДНК-лигазы одинаково быстро и эффективно сшивают как липкие, так и тупые концы. Одна из таких разновидностей лигаз используется в готовых наборах для клонирования CloneJET PCR, Thermo Fisher Scientific.

Наборы CloneJET PCR – это оптимизированные системы с позитивной селекцией для эффективного клонирования ПЦР-продуктов, синтезированных любыми термостабильными ДНК-полимеразами. С помощью наборов CloneJET PCR можно клонировать ДНК-фрагменты с любыми концами – тупыми или липкими, фосфорилированными или не фосфорилированным. Лигирование занимает всего 5 минут, а выход рекомбинантных клонов составляет более 99% благодаря использованию вектора pJET1.2/blunt с позитивной системой селекции.

Примеры применения:

клонирование продуктов ПЦР с тупым или 3′-dA-концом длиной до 10 кб;
клонирование фрагментов ДНК, генерируемых рестрикционными ферментами;
секвенирование клонированной ДНК;
транскрипция in vitro и in vivo клонированных вставок из промотора T7.

Клонирование с использованием наборов CloneJET PCR включает в себя этап достройки липких концов, получающихся при использовании для ПЦР стандартной Taq-полимеразы или при рестриктазном расщеплении ДНК. При этом реакция лигирования тупоконечной вставки длиной до 3000 пар нуклеотидов с линейным вектором занимает всего 5 минут (при более длинных вставках время лигирования увеличивается). Позитивная селекция клонов со вставкой осуществляется за счёт встраивания клонируемого фрагмента в последовательность летального гена eco47IR, тем самым выключая этот ген и обеспечивая жизнеспособность рекомбинантных клонов.

Преимущества наборов CloneJET PCR:

универсальный вариант для клонирования фрагментов с тупым или липким концами;
быстрое клонирование ПЦР-фрагмента всего за 5 минут;
эффективность – более 99% положительных клонов;
отсутствие фоновых клонов с «пустым» вектором.

EL0016

2х500 единиц

16 394, руб.

ДНК-лигаза Т4 катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5’-фосфорилированным и 3’-гидроксилированным концами двух фрагментов двойной цепи ДНК или РНК. Фермент восстанавливает однонитевые разрывы в двойных цепях ДНК, РНК или гибридов ДНК/РНК. ДНК-лигаза сшивает как липкие, так и тупые концы, но не однонитевые нуклеиновые кислоты.

В качестве кофермента требуется наличие АТФ.

ДНК-лигаза Т4 от Thermo Scientific активна в рестриктазных буферах, лигазном буфере и буфере для обратной транскрипции.

Реакция лигирования липких концов происходит в течение 10 минут при комнатной температуре.

Для лигирования тупых концов в комплект входит раствор полиэтиленгликоля.

Области применения:

Клонирование фрагментов ДНК или ПЦР-фрагментов в вектор после рестрикции;
пришивка олигонуклеотидных линкеров и адапторов к ДНК;
лигазная детекция РНК ;
репарация 1-цепочечных разрывов в двухцепочечных молекулах нуклеиновых кислот;
циркуляризация линейной ДНК.

ДНК-лигаза Т4 Thermo Scientific комплекутется 10-кратным лигазным буфером и 50% растворов ПЭГ.

Активность ДНК-лигазы может измеряться в единицах лигирования липких концов (лигирование 50% HindIII-фрагментов ДНК фага в течение 30 минут) или в единицах Вейсса (каталитическое превращение 1 нмоль дифосфата в течение 20 минут). 1 единица Вейса равна 200 единицам лигирования липких концов.

Важно!

1) Связывание лигазы с ДНК може приводить к смещению полос в агарозном геле. Во избежание подобного смещения рекомендуется добавлять к электрофорезным образцам буфер для нанесения с SDS и инкубировать образцы в течение 10 минут при +65^оС, а затем охладить во льду.

2) При электротрансформации лигазной смеси необходимо произвести очистку ДНК от фермента (на спин-колонках или фенол-хлороформной экстракцией)

Условия хранения: -20^оС

EL0014

200 единиц

хранение -30…-5°C, транспортировка сухой лед

19 954, руб.

EL0011

1000 единиц Вейсса

16 487, руб.

EL0012

5х1000 единиц

57 043, руб.

В качестве кофермента требуется наличие АТФ.

Реакция лигирования липких концов происходит в течение 10 минут при комнатной температуре.

Для лигирования тупых концов в комплект входит раствор полиэтиленгликоля.

Области применения:

Клонирование фрагментов ДНК или ПЦР-фрагментов в вектор после рестрикции;
пришивка олигонуклеотидных линкеров и адапторов к ДНК;
лигазная детекция РНК ;
репарация 1-цепочечных разрывов в двухцепочечных молекулах нуклеиновых кислот;
циркуляризация линейной ДНК.

ДНК-лигаза Т4 Thermo Scientific комплекутется 10-кратным лигазным буфером и 50% растворов ПЭГ.

Важно!

Условия хранения: -20^оС

EK0031

500 единиц

8 927, руб.

EK0032

2500 единиц

37 997, руб.

Полинуклеотидкиназа Т4 катализирует перенос гамма-фосфата от АТФ на 5’-концевую ОН-группу ДНК, РНК, олигонуклеотидов или нуклеозид-3’-монофосфатов (прямая реакция).Эта реакция обратимая. В присутствии АДФ полинуклеотидкиназа проявляет 5’-фосфатазную активность и катализирует обмен фосфатными группами между 5’-фосфорилированными полинуклеотидными цепями и АТФ (реакция обмена). Также фермент обладает 3’-фосфатазной активностью.

Полинуклеотидкиназа Т4 от Thermo Scientific активна в рестриктазных буферах, лигазном буфере и буфере для обратной транскрипции.

Области применения:

Мечение 5’-концов нуклеиновых кислот с целью получения гибридизационных зондов, зондов для транскриптов, маркеров для электрофореза, праймеров для секвенирования и ПЦР;
5’-фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов, ПЦР-продуктов, ДНК и РНК перед лигированием;
выявление модификаций ДНК с помощью [³²P];
отщепление 3’-концевых фосфатов.

Полинуклеотидкиназа Т4 Thermo Scientific комплектуется 10-кратными буферами А (для прямой реакции), В (для реакции обмена) и 24% раствором ПЭГ 6000.

Полиэтиленгликоль повышает эффективность реакции фосфорилирования и используется в реакции обмена.

Важно! Полинуклеотидкиназа ингибируется ионами аммония, поэтому при осаждении фосфорилируемой ДНК рекомендуется использовать ацетат натрия.

Условия хранения: -20^оС

Реактивы и наборы для выделения нуклеиновых кислот:

Thermo FS Набор для выделения ДНК из костной ткани/PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kit
4463352исг	100 выделений		По запросу По запросу

Thermo FS Вода без нуклеаз, обработанная диэтилпирокарбонатом (аналоги арт. 3783.0005, 3783.0050, Диаэм)
R0603
R0603	5×1 мл	хранение -20°C	5 192, руб.
R0601	30 мл	хранение -20°C	8 570, руб.
Деионизованная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) и отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для экспериментов с использованием РНК. Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз. Не предназначена для ПЦР и экспериментов in vivo.

Thermo FS ТРИзол — реагент для выделения РНК, ДНК и белков (аналоги арт. 3789.0100, арт. 3789.0250, Диаэм)
15596026
15596026	100 мл		59 627, руб.
15596018	200 мл		92 738, руб.
ТРИзол — готовый к использованию реагент для выделения РНК высокого качества. Также используется для выделения ДНК, РНК и белков из широкого спектра биологических образцов — тканей, клеток, жидкостей и др. Это однофазная смесь фенола и гуанидин-изотиоцианата, разработанная для выделения фракций ДНК, РНК и белков из одного и того же биологического образца. Выполнение протокола выделения РНК с помощью ТРИзол занимает около одного часа. Реагент обеспечивает эффективный лизис и даёт возможность получения РНК высокого качества за счёт ингибирования РНКаз. Выделение фракций ДНК, РНК и белков осуществляется с помощью добавления к ТРИзол хлороформа. Условия хранения: при комнатной температуре

Thermo FS РНКаза А, не содержит ДНКаз и протеаз, 10 мг/мл
EN0531	10 мг	транспортировка -20°C	9 904, руб.
РНКаза А — эндорибонуклеаза, расщепляющая одноцепочечную РНК по цитозиновым и урациловым остаткам. Так как РНКаза А от Thermo Scientific не содержит ДНКаз, не требуется её термическая обработка перед использованием. Области применения: Выделение плазмидной и геномной ДНК; удаление РНК из препаратов рекомбинантных белков; исследования защищённости от РНКаз (совместно с РНКазой Т); картирование 1-нуклеотидных мутаций в ДНК и РНК. Рекомендуемая рабочая концентрация РНКазы А — от 1 до 100 мкг/мл. В присутствии NaCl в низких концетрациях (до 100 мМ) РНКаза А расщпляет 1- и 2-цепочечную РНК, а также цепь РНК в составе гибридов ДНК-РНК. В присутствии NaCl в концентрации 0.3М и выше РНКаза А расщепляет только 1-цепочечную РНК. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Протеиназа К, рекомбинантная, PCR-grade, 20 мг/мл
EO0491
EO0491	1 мл	транспортировка -20°C	7 254, руб.
EO0492	5х1 мл	транспортировка -20°C	38 836, руб.
Протеиназа К — эндопротеаза широкого спектра действия., расщепляющая белки даже в присутствии детергентов. Относится к классу сериновых протеаз. Протеиназа К гидролизует пептидные связи со стороны карбоксильной группы алифатических, ароматических и гидрофобных аминокислот. Минимальный размер расщепляемого пептида — 4 аминокислоты. Протеиназа К Thermo Scientific — готовый к использованию раствор с концентрацией не менее 600 ед/мл (20 мг/мл). Области применения: Выделение нуклеиновых кислот из животных тканей и клеточных культур; удаление ДНКаз и РНКаз в процессе выделения и очистки нуклеиновых кислот; определение локализации ферментов. Рекомендуемая рабочая концентрация фермента — от 0.05 до 1 мг/мл. Активность фермента повышается в присутствии 0.2-1% SDS или 1-4 М мочевины. Ионы кальция являются фактором регуляции связывания протеиназы К с субстратом и повышают стабильность фермента. Оптимальное значение рН — от 7.5 до 8, но белок стабилен при рН от 4 до 12. Оптимальная температура — +50-55^оС, при нагревании свыше +65^оС протеиназа К инактивируется.

Thermo FS Набор GeneJET для экстракции ДНК из агарозного геля
K0691
K0691	50 выделений		26 723, руб.
K0692	250 выделений	хранение комбинированный, транспортировка комнатная температура	76 250, руб.
Наборы серии GeneJET предназначены для выделения ДНК и РНК из различных биологических источников с использованием технологии спин-колонок. Сорбция происходит на мембране из диоксида кремния. Набор для экстракции из геля предназначен для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения. С помощью набора можно очистить фрагменты ДНК от 25 до 20 тыс. п.н. с выходом до 95%. Ёмкость колонок GeneJET — до 25 мкг ДНК, выделяемой из 1 г агарозного геля. Выделеннная ДНК пригодна для рестрикции, лигирования, секвенирования, мечения и т.д. Условия хранения: комнатная температура.

Thermo FS Набор GeneJET для выделения РНК
K0731	50 выделений	хранение комбинированный, транспортировка комбинированный	51 042, руб.
Наборы серии GeneJET предназначены для выделения ДНК и РНК из различных биологических источников с использованием технологии спин-колонок. Сорбция происходит на мембране из диоксида кремния. Данный набор предназначен для выделения суммарной РНК из различных биологических образцов — культур животных клеток, животных тканей, человеческих клеток крови, бактерий и дрожжей. С помощью набора GeneJET можно получить препарат чистой РНК (А260/280 > 1.9) с длиной фрагментов не менее 200 нуклеотидов. Полученная РНК пригодна для молекулярно-биологических экспериментов, таких, как обратная транскрипция, ОТ-ПЦР, ОТ-количественная ПЦР и гибридизация. Условия хранения: комнатная температура

Thermo FS Набор GeneJET Plasmid Miniprep для выделения плазмидной ДНК из бактерий
K0502
K0502	50 выделений		15 564, руб.
K0503	250 выделений		60 222, руб.
Наборы GeneJET Plasmid Miniprep предназначены для выделения плазмидной ДНК из бактерий с использованием технологии спин-колонок. Сорбция происходит на мембране из диоксида кремния. Набор позволяет получить до 20 мкг высококопийной плазмидной ДНК за одну процедуру выделения. Преимущества набора GeneJET Plasmid Miniprep: процедура выделения занимает менее 14 минут; не требуется экстракция фенолом/хлороформом или осаждение спиртом; очищенная ДНК немедленно готова к использованию; совместим с вакуумным коллектором для увеличения пропускной способности; оптимизирован для выделения ДНК бактерий. Выделенная набором GeneJET Plasmid Miniprep ДНК пригодна для следующих молекулярно-биологических манипуляций: рестрикции и модификации; автоматизированного флуоресцентного и радиоактивного секвенирования; ПЦР; in vitro транскрипции; трансформации. Состав набора GeneJET Plasmid Miniprep: раствор для ресуспендирования клеток; раствор для лизиса клеток; раствор для нейтрализации лизата; промывочный раствор (концентрат); раствор РНКазы А; буфер для элюции; спиновые колонки; трубки для сбора элюата; подробный протокол работы. Культуру клеток собирают и лизируют. Затем лизат очищают центрифугированием и наносят на колонку с кремнеземом для селективного связывания молекул ДНК при высокой концентрации соли. Адсорбированную ДНК промывают для удаления загрязнений, а чистую плазмидную ДНК элюируют в небольшом объеме элюционного буфера или воды. Условия хранения и перевозки — комнатная температура.

Thermo FS ДНКаза I, раствор, не содержит РНКаз, 1 ед/мкл
EN0521	1000 е.а.	транспортировка -20°C	14 152, руб.
ДНКаза I — эндонуклеаза, расщепляющая одно- и двухцепочечную ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов и монодезоксинуклеотидов с 5’-фосфатом и 3’-OH. Так как фермент рекомбинантный, его раствор не содержит РНКаз. Активность ДНКазы I зависит от присутствия ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, а также Mn²⁺. В присутствии Mg²⁺ фермент расщепляет каждую цепь двухцепочечной ДНК независимо друг от друга, случайным образом. В присутствии Mn²⁺ расщепление обеих цепей двухцепочечной ДНК происходит приблизительно в одном и том же месте, при этом концы фрагментов ДНК — тупые или выступающие на 1-2 нуклеотида. Применение: Получение препаратов РНК, не содержащих примеси ДНК; расщепление матрицы ДНК после транскрипции in vitro; обратная транскрипция; мечение ДНК методом ник-трансляции (с использованием ДНК-полимеразы I); изучение взаимодействий «ДНК-белок» методом футпринтинга; получение библиотек вставок ДНК, перекрывающихся случайным образом. Фермент комплектуется двумя 10-кратными реакционными буферами — с MgCl₂ и без MnCl₂ Важно! ДНКаза I чувствительна к физической денатурации — не перемешивать на вортексе или пипетированием. Перемешивать только переворачиванием пробирки. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Гликоген, для работы с РНК и ДНК
R0551	2х0.1 мл	транспортировка -20°C	18 590, руб.
Гликоген — полисахарид высокой степени чистоты. Выделен из двустворчатых моллюсков. Используется в качестве инертного соосадителя при преципитации нуклеиновых кислот спиртами. Он не растворим в этаноле и способствует образованию более прочного и видимого осадка нуклеиновой кислоты после центрифугирования. Гликоген более эффективен при высаживании нуклеиновых кислот, чем тРНК, линейный акриламид или фрагментированная ДНК. Данный продукт рекомендуется в первую очередь для преципитации РНК, а также ДНК. Идеален для преципитации олигонуклеотидов (более 8 оснований) и РНК/ДНК в низкой концентрации (20 пг и более). Не влияет на спектральные характеристики нуклеиновых кислот. При концентрации до 0.4 мкг/мкл совместим с трансфекцией. При концентрации до 8 мкг/мкл совместим с ферментативными реакциями — ПЦР, лигированием, рестрикцией, синтезом кДНК, трансформацией, транскрипцией in vitro. Не влияет на электрофоретическую подвижность нуклеиновых кислот. Условия хранения: -20^оС

Thermo FS Набор GeneJET для выделения геномной ДНК
K0721
K0721	50 выделений	транспортировка -20°C	30 030, руб.
K0722	250 выделений		124 724, руб.
Наборы серии GeneJET предназначены для выделения ДНК и РНК из различных биологических источников с использованием технологии спин-колонок. Сорбция происходит на мембране из диоксида кремния. С помощью данного набора можно выделить геномную ДНК (длина фрагментов — свыше 30 тыс. п.н.) из культур животных клеток, образцов животных тканей, цельной крови, бактерий и дрожжей. Выделенная ДНК пригодна для большинства молекулярно-биологических экспериментов — ПЦР, гибридизации, рестрикции и др. Условия хранения: комнатная температура

Реактивы для электрофореза и блоттинга белков и НК:

B0004исг

250 мкл

NW00102BOXисг

Стандартная
цена: 28 040,=.
Скидка 50%.

Стандартная
цена: .
Скидка 50%.

10 шт./уп.

SM0331

5х50 мкг

19 806, руб.

Маркер молекулярного веса ДНК GeneRuler Mix содержит 15 фрагментов ДНК от от 75 до 20000 п.н.; фрагменты: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000; имеет эталонные полосы (повышенной концентрации) при 500, 1000 и 3000 п.о., что облегчает их идентификацию в геле; поставляется с буфером для нанесения; условия хранения: -20 °C.

SM0323

50 мкг

18 648, руб.

Маркер молекулярного веса ДНК GeneRuler 100 bp Plus содержит 14 фрагментов от 100 до 3000 п.н.; фрагменты: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 п.н.; имеет эталонные полосы (повышенной концентрации) при 500 и 1000 п.н., что облегчает идентификацию в геле; предварительно смешан с буфером для нанесения; рекомендуемый объём для нанесения на гель — 1 мкл; условия хранения: при комнатной температуре или при 4 °С до 6 месяцев, более длительное хранение при -20 °C.

SM0371

50 мкг

14 807, руб.

Маркер молекулярного веса ДНК GeneRuler 50bp содержит 13 фрагментов от 50 до 1000 п.н.; фрагменты: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 п.н.; имеет эталонные полосы (повышенной концентрации) при 250 и 500 п.н., что облегчает идентификацию в геле; поставляется с с буфером для нанесения; условия хранения: -20 °C.

SM0311

5х50 мкг

19 542, руб.

Маркер молекулярного веса ДНК GeneRuler 1 kb содержит 14 фрагментов от 250 до 10000 п.н.; фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.; имеет эталонные полосы (повышенной концентрации) при 6000, 3000 и 1000 п.н., что облегчает идентификацию в геле; поставляется с буфером для нанесения; хранение при – 20 °С.

SM0241

50 мкг

11 928, руб.

Маркер молекулярного веса ДНК GeneRuler 100 bp содержит 10 фрагментов от 100 до 1000 п.н.; фрагменты: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 п.н.; имеет эталонную полосу (повышенной концентрации) при 500 п.н., что облегчает идентификацию в геле; поставляется с буфером для нанесения; условия хранения: -20 °C.

SM0243

50 мкг

хранение +2…+8°C, транспортировка +2…+8°C ОБЯЗАТЕЛЬНО!!!

14 799, руб.

Маркер молекулярного веса ДНК GeneRuler 100 bp содержит 10 фрагментов от от 100 до 1000 п.н.; фрагменты: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 п.н.; имеет эталонную полосу (повышенной концентрации) при 500 п.н., что облегчает идентификацию в геле; предварительно смешан с буфером для нанесения; рекомендуемый объём для нанесения на гель — 1 мкл; условия хранения: -20 °C.

SM0322

5х50 мкг

46 682, руб.

Маркер молекулярного веса ДНК GeneRuler 100 bp Plus содержит 14 фрагментов от от 100 до 3000 п.н.; фрагменты: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 п.н.; имеет эталонные полосы (повышенной концентрации) при 500 и 1000 п.н., что облегчает идентификацию в геле; поставляется с буфером для нанесения для отслеживания миграции фрагментов ДНК на гель-электрофорезе; условия хранения: -20 °C.

R0631

5х1 мл

8 161, руб.

Используется при приготовлении маркеров и образцов для нанесения на полиакриламидный или агарозный гель. Содержит два красителя (ксиленцианол FF (XCFF)) и оранжевый G/ orange G для визуализации фрагментов во время фореза, глицерин для равномерной загрузки на дно лунки и ЭДТА для связывания двухвалентных тонов металлов и ингибирования металл-зависимых протеаз. Не маскирует ДНК при УФ-экспозиции. Используется для анализа коротких фрагментов ДНК.

10 мM Tрис-HCl (pH 7,6), 0,15% оранжевый G, 0,03% ксиленцианол FF, 60% глицерин, 60 мM ЭДТА.

R0611

5х1 мл

транспортировка -8…+2°C

8 313, руб.

Применение: гель-электрофорез.

Реагент для приготовления образцов ДНК и маркеров для электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Содержит цветные маркерные красители Бромфеноловый синий и ксиленцианол FF для визуального контроля за миграцией фрагментов ДНК в геле. Также в состав реагента входят глицерин в качестве утяжеляющего агента и ЭДТА в качестве ингибитора нуклеаз.

Не мешает визуализации ДНК в ультрафиолете.

10 мM Tрис-HCl (pH 7,6), 0,03% бромфеноловый синий, 0,03% ксиленцианол FF, 60% глицерин, 60 мM ЭДТА.

SM1103

2х500 мкл

транспортировка -8…+2°C

15 330, руб.

Маркер ДНК FastRuler Low Range предназначен для быстрого определения длины и приблизительной концентрации фрагментов 2-цепочечной ДНК в специальных 48- или 96-луночных гелях для высокопроизводительного электрофореза, но может использоваться и в обычных агарозных гелях; содержит смесь пяти фрагментов ДНК с тупыми концами: 50, 200, 400, 850, 1500 п.н., которые быстро (в течение 8-14 минут) разделяются при коротком пробеге (10-20 мм) в соответствующем агарозном геле;, комплектуется 6-кратным буфером для нанесения, хотя содержит краситель и утяжеляющий агент для нанесения на гель; может быть визуализирован этидиум бромидом или SYBR Safe; условия хранения: -20 °C.

B52

1 л

10 059, руб.

Предназначен для электрофореза нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле в нативных и денатурирующих условиях (7 М мочевина), а также для секвенирования ДНК методом капиллярного электрофореза. Рекомендуется для разделения фрагментов нуклеиновых кислот до 1500 нуклеотидов. ТВЕ может использоваться с агарозными гелями, но не рекомендуется для препаративного электрофореза. Так как борат является ингибитором ферментов, не рекомендуется использовать в случае последующих ферментативных модификаций ДНК. Отфильтрован через мембрану 0,22 мкм.

B49

1 л

19 672, руб.

Предназначен для электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном и полиакриламидном гелях. Используется как электродный буфер, буфер для заливки гелей и буфер для приготовления образцов. Отфильтрован через мембрану 0,22 мкм. Рекомендуется для электрофоретического разделения фрагментов ДНК и РНК длиной более 1000 нуклеотидов, геномной ДНК и суперскрученной ДНК.

R0801

25 г

31 413, руб.

Агароза TopVision — легкоплавкая агароза, предназначенная для препаративного разделения фрагментов нуклеиновых кислот методом электрофореза, а также для постановки ферментативных реакций в геле.

Оптимальная концентрация — 0.7 — 2%

Имеет сертификат GQ (genetic quality), что означает пригодность очищенных с её помощью нуклеиновых кислот для молекулярно-биологических экспериментов.

Не содержит ДНКаз и РНКаз.

Не связывает ДНК и РНК.

Пригодна для анализа РНК.

Формирует прозрачный гель.

Области применения:

аналитический электрофорез нуклеиновых кислот
препаративный электрофорез
ферментативные реакции в геле

Условия хранения: комнатная температура.

S33102

400 мкл

23 707, руб.

Цвет оранжевый
Длина волны возбуждения флуоресценции, нм 280 (УФ), 502 (голубой)
Длина волны испускания флуоресценции, нм 530 нм (зеленый)
Температура кипения, ºС 189
Температура плавления, ºС 18,4
Температура вспышки, ºС 94
Условия хранения -20 ºС, в темном месте; в оригинальной таре при комнатной температуре
Индекс риска (R): 20,22,26, 36/37/38, 68 вреден при попадании в дыхательные пути
Индекс безопасности (S): 9,36,60

Индекс риска (R)	20,22,26-36/37/38-68 вреден при попадании в дыхательные пути
Индекс безопасности (S)	9,36,60

Реактивы и аксессуары для секвенирования по Сэнгеру:

Культуральные среды, сыворотки, заменители, добавки:

Thermo FS Актин
A12375		1 мг			По запросу По запросу

Thermo FS Фунгизон противогрибковый, жидкость
15290018		20 мл	хранение -20°C, транспортировка сухой лед		2 606, руб.


Thermo FS Витамины для культур клеток, (100х в пересчете на среду MEM)
11120037		100 мл	хранение -20…-5°C		1 899, руб.

Thermo FS Среда для кариотипирования PB-MAX (1x), жидкая (аналог Лимфокар-2, арт. H10, Россия; Амниокар, арт. H211, Россия)
12557013
12557013		100 мл	хранение -20°C, транспортировка сухой лед	РУ Регистрационное удостоверение на медицинское изделие Росздравнадзора	12 400, руб.
12557021исг	Стандартная цена: 56 894,=. Скидка 50%. Стандартная цена: . Скидка 50%.	500 мл		РУ Регистрационное удостоверение на медицинское изделие Росздравнадзора	СПЕЦЦЕНА 28 447, руб.


Thermo FS Среда MEM, с GlutaMAX, с солями Эрла
41090028		500 мл	транспортировка -8…+2°C		2 576, руб.
Среда DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium — модификация среды BME (Basal Medium Eagle), содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, а также различные добавки, улучшающие рост клеток. Среды DMEM выпускаются с высоким и пониженным содержанием глюкозы, с и без пирувата натрия, с добавками для культивирования клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридов. Среда DMEM выпускается как в жидком виде, так и в форме порошка.

Thermo FS Среда StemFlex, бессывороточная, для культивирования мезенхимальных стволовых клеток
A3349401		1 набор	хранение комбинированный, транспортировка -20°C		111 526, руб.
Среда StemFlex Medium обеспечивает долгосрочное культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), без использования фидера. Применение данной среды позволяет снизить риск кариотипических аномалий и поддерживает способность клеток дифференцироваться во все три зародышевых слоя. Среда является идеальным решением для таких применений как пассаж единичных клеток, редактирование генома и репрограммирование клеточных линий. Уникальная формула StemFlex обеспечивает удобство и гибкость графика работы с клеточными линиями (включая варианты без работы в выходные), а также возможность применения различных матриксов и добавок, которые лучше всего подходят для конкретных линий. В комплекте: среда базальная StemFlex, 450 мл; добавка StemFlex, 50 мл.

Thermo FS Среда RPMI 1640, с глутамином, без пирувата, с феноловым красным, без ХЕПЕС
11875093
11875093		500 мл			10 405, руб.
11875085		1 л			16 928, руб.
Среда RPMI-1640 была разработана в Roswell Park Memorial Institute в 1966 Муром и его коллегами для культивирования лейкоцитов. В настоящее время используется для широкого спектра клеточных культур.

Thermo FS Среда Advanced DMEM, высокое содержание глюкозы, без глутамина, без ХЕПЕС, с феноловым красным
12491015
12491015		500 мл	хранение +2…+8°C		6 073, руб.
12491023		10х500 мл	хранение +4°C, транспортировка комнатная температура		54 710, руб.
Среда DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium — модификация среды BME (Basal Medium Eagle), содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, а также различные добавки, улучшающие рост клеток. Среды DMEM выпускаются с высоким и пониженным содержанием глюкозы, с и без пирувата натрия, с добавками для культивирования клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридов. Среда DMEM выпускается как в жидком виде, так и в форме порошка.

Thermo FS Среда Advanced RPMI 1640, без глутамина, с пируватом, без ХЕПЕС, с феноловым красным
12633012
12633012		500 мл	хранение +2…+8°C		6 084, руб.
12633020		10х500 мл	транспортировка -8…+2°C		57 709, руб.
Среда RPMI-1640 была разработана в Roswell Park Memorial Institute в 1966 Муром и его коллегами для культивирования лейкоцитов. В настоящее время используется для широкого спектра клеточных культур.

Thermo FS Среда MEM α, с нуклеотидами, с глутамином, с феноловым красным
22571020
22571020		500 мл	транспортировка -8…+2°C		8 118, руб.
22571038		10х500 мл	хранение +4°C		56 861, руб.
Среда MEM (Minimum Essential Medium, среда Игла) разработана Гари Иглом и является наиболее распространенной средой для культивирования клеток наряду со средой DMEM. Среда содержит 13 аминокислот, 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. Есть модификации среды МЕМ с солями Эрла и Хэнкса, а также α-модификация среды MEM с содержанием всех 21 аминокислот и солями Эрла.

Thermo FS Раствор Хэнкса (HBSS) с кальцием и магнием
24020091исг
24020091исг	Стандартная цена: 4 678,=. Скидка 50%. Стандартная цена: . Скидка 50%.	500 мл			СПЕЦЦЕНА 2 339, руб.
24020091		500 мл			3 892, руб.
24020133		10х500 мл			41 766, руб.

Thermo FS Пенициллин-стрептомицин (10,000 ЕД/мл)
15140148
15140148		20 мл	хранение -20…-5°C, транспортировка сухой лед		2 238, руб.
15140122исг	Стандартная цена: 3 966,=. Скидка 50%. Стандартная цена: . Скидка 50%.	100 мл			СПЕЦЦЕНА 1 983, руб.
15140122		100 мл	транспортировка сухой лед		2 582, руб.


Thermo FS Среда DMEM, низкое содержание глюкозы, с GlutaMAX-I, с пируватом, с феноловым красным
21885025
21885025		500 мл	транспортировка -8…+2°C		3 339, руб.
21885108		10х500 мл	хранение +2…+8°C, транспортировка темп окружающ среды (ambient)		34 130, руб.
Среда DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium — модификация среды BME (Basal Medium Eagle), содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, а также различные добавки, улучшающие рост клеток. Среды DMEM выпускаются с высоким и пониженным содержанием глюкозы, с и без пирувата натрия, с добавками для культивирования клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридов. Среда DMEM выпускается как в жидком виде, так и в форме порошка.

Антитела первичные и вторичные:

Thermo FS Антитела Tenascin R, кроличьи поликлональные
PA550580	100 мкл	хранение -20°C	75 717, руб.
Антитело обнаруживает эндогенные уровни общего белка Тенасцина R. Тенасцин-R (TNR) представляет собой белок внеклеточного матрикса, экспрессируемый главным образом в центральной нервной системе. Он является членом семейства генов тенасцина (TN), которое у млекопитающих включает как минимум 3 гена: TNC (или hexabrachion; MIM 187380), TNX (TNXB; MIM 600985) и TNR (Erickson, 1993). Гены экспрессируются в разных тканях в процессе эмбрионального развития и присутствуют в тканях взрослого организма. Характеристики антител Tenascin R Видовая специфичность – человек, мышь, крыса; изотип – IgG; иммуноген – синтетический пептид, соответствующий области, полученной из внутренних остатков человеческого тенасцина R; конъюгация – неконъюгированные; концентрация мг/мл – 2,2; очистка – аффинная хроматография; буфер для хранения – PBS, pH 7,4, с 40% глицерина, содержит 0,05% азида натрия; условия хранения, °С – -20.

Источник

Многие методы исследования в области молекулярной биологии требуют миллионов идентичных копий чистой ДНК. Полимеразная цепная реакция — это молекулярный метод, имитирующий процесс репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты для амплификации определенных сегментов ДНК in vitro. Реакция повторяется через серию изменений температуры, во время которых нити ДНК разделяются, праймеры связываются и образуются комплементарные нити.

Эволюция ДНК-полимераз
Что такое полимеразная цепная реакция
Компоненты полимеразной цепной реакции
Этапы полимеразной цепной реакции
Анализ новообразованных цепочек ДНК
Какие результаты анализов дает ПЦР
Наиболее важные области применения ПЦР
Продолжение статьи

Эволюция ДНК-полимераз

Прогресс в ПЦР был бы невозможен без эволюции ДНК-полимераз — специализированных ферментов.

История современной ПЦР началась в 1976 году с выделения ДНК-полимеразы Taq из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Выявление бактерии означало, что у молекулярных биологов появился термостабильный фермент, способный к повторному циклу ПЦР без необходимости добавления свежей ДНК-полимеразы после каждого цикла.

Однако влияние, которое фермент Taq окажет на молекулярную биологию, не был ясен до 1988 года, пока фермент не коммерциализировали для широкого использования. ДНК-полимераза Taq имела мгновенный успех, и в 1989 г. даже была названа журналом Science «Молекулой года».

Хотя эти разработки представляли собой значительный прогресс, ДНК-полимераза Taq не была идеальной. Анализ с ее использованием был нестабилен при высоких температурах и подвержен ошибкам. Эти факторы сыграли роль в задержке развития возможностей ПЦР на раннем этапе, особенно в приложениях, требующих высокой специфичности и надежности. Вскоре стало очевидно, что разработка ДНК-полимераз неразрывно связана с эффективным использованием ПЦР, и что для увеличения мощности ПЦР и открытия более широкого спектра возможностей анализа необходимо разработать более совершенные ДНК-полимеразы.

В конце 1980-х годов появился ряд методов с использованием «горячего старта», помогающих преодолеть неэффективность и низкую специфичность ДНК-полимеразы Taq при высоких температурах. Эти методы заключались в нагревании образцов до 95°C и последующем охлаждении до 60–70°C перед добавлением полимеразы. Несмотря на эффективность, методы горячего старта отнимали много времени и часто вызывали перекрестное загрязнение проб. ПЦР требовалось долгосрочное решение.

В 1991 г. были выделены и разработаны полимеразы Pfu, полученные из гипертермофильных архей Pyrococcus furiosus. ДНК-полимераза Pfu, в отличие от ДНК-полимеразы Taq, имеет встроенную корректирующую активность экзонуклеазы от 3 ‘до 5’, что означает, что она может исправлять ошибки включения нуклеотидов, значительно снижать частоту ошибок и обеспечивать повышенную специфичность. Разработка и использование как полимераз Pfu, так и Taq продолжались в течение некоторого времени, при этом ПЦР сыграла важную роль в ряде новаторских исследований, таких как секвенирование.

Внедрение слитых ДНК-полимераз в 2003 году, стало первым шагом в разработке полимераз нового поколения и ПЦР высокой точности. Эти специально сконструированные ДНК-полимеразы могли преодолеть или уменьшить многие проблемы, все еще ограничивающие развитие ПЦР. Созданные путем слияния основных компонентов архебактериальной полимеразы с термостабильным ДНК-связывающим доменом, первые ДНК-полимеразы Phusion High Fidelity обладали сильной корректирующей способностью и были невероятно стабильны при высоких температурах реакции. Кроме того, при использовании специализированного ДНК-связывающего домена сродство полимеразы к двухцепочечной ДНК увеличивалось в геометрической прогрессии.

Разработка полимераз следующего поколения наряду с развитием технологий ПЦР в реальном времени и цифровой ПЦР гарантировала, что ПЦР будет играть важную роль в будущих исследованиях в области наук о жизни и здравоохранении.

Что такое полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Он состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), составляющей генетический код человека, а также животных и растений.

В медицине анализ используется для уточнения наследственных заболеваний и генетических проблем (риск заболевания, тест на отцовство и т. д.), а также для диагностики многих инфекционных заболеваний. В отличие от серологической диагностики (определение антител к возбудителям в крови) способы полимеразной цепной реакции представляют собой прямой лабораторно-медицинский метод выявления в рамках уточнения инфекционных заболеваний.

Преимущество этого способа диагностики — быстрая доступность результатов. Кроме того, методы полимеразной цепной реакции обладают очень высокой чувствительностью. Это означает, что даже минимальное количество генетического материала от возбудителя (бактерии, вирусы и т. д.) приводит к достоверно положительному результату при наличии соответствующего патогена в нужном исследуемом материале.

Кровь — основной исследуемый материал для этого метода, однако используются и другие биологические жидкости (мокрота, моча, ликвор и т. д.). В основе генетического материала лежит особая длинноцепочечная молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты.

У людей генетический материал, состоящий из двухцепочечной ДНК (две комплементарные нити), находится в ядре всех клеток организма, при этом они имеют идентичный генетический материал. Кроме того, индивидуальный геном каждого человека уникален по своему точному составу и сравним с отпечатком пальца, также уникального для каждого человека.

По этой причине генетический материал также называют «генетический код». В этой форме закодирована схема всех структур человеческого организма, таким образом она сохраняется и в дальнейшем может передаваться по наследству.

В ядрах клеток тела дезоксирибонуклеиновая кислота присутствует в особом порядке, известном как хромосомы (наследственные клетки). У людей они всегда встречаются парами, причём, одна наследуется от матери, а другая — от отца. Все клетки человеческого тела содержат в общей сложности 46 хромосом — 22 пары, называемые аутосомами, и одну пару, называемую половыми хромосомами.

Лабораторная процедура может быть использована для исследования тонкой структуры генетического кода человека, что важно при диагностике заболеваний или уточнении конкретных вопросов:

выявление наследственных заболеваний;
оценка риска заболевания;
исследование врожденных особенностей обмена веществ;
судебно-медицинская (так называемая «криминалистическая») экспертиза.

Не только люди, но и фактически все формы жизни на Земле имеют определенный генетический материал:

грибы;
бактерии;
вирусы;
паразиты и др.

Геном этих форм жизни также состоит в основном из ДНК или, в варианте некоторых вирусов, также из РНК (рибонуклеиновая кислота), которая, в отличие от ДНК — одноцепочечная. Поэтому в медицинской диагностике этот метод также проводится для уточнения многих инфекционных заболеваний:

бактериальные инфекции, например, туберкулез, бактериальные венерические заболевания;
вирусные инфекции, например, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция;
паразитарные инфекции, например, малярия, и многое другое.

Компоненты полимеразной цепной реакции

ПЦР включает следующие компоненты:

ДНК-матрица (образец дезоксирибонуклеиновой кислоты, с целевой последовательностью для амплификации);
дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
буфер;
праймеры (прямые и обратные) – короткий сегмент нуклеотидов, комплементарный участку ДНК или РНК, необходимый для амплификации. В этой методике используются две короткие последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, предназначенные для связывания с началом (прямой праймер) и концом (обратный праймер) последовательности – мишени.
Taq-полимераза — термостабильная ДНК-полимераза, первоначально выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus, сопротивляющаяся инактивации при температурах денатурации и позволяющая удлинять праймеры при высокой температуре.

Этапы полимеразной цепной реакции

Для проведения лабораторного исследования, извлеченный образец (содержащий шаблон ДНК-мишени) добавляют в пробирку, содержащую праймеры, свободные нуклеотиды (dNTP) и полимеразу Taq. Смесь помещают в лабораторное оборудование (термоциклер, ДНК-амплификатор) для проведения анализа. Термоциклер увеличивает и уменьшает температуру смеси для соответствующего анализа автоматическими запрограммированными шагами, экспоненциально генерирующими копии целевой последовательности.

Полимеразная цепная реакция включает три основных этапа:

Денатурация (разделение цепей). Разделение двух комплементарных цепей ДНК, связанных водородными связями, на пару одноцепочечных полинуклеотидных молекул в процессе нагревания (от 94C до 96C);
Отжиг (связывающий праймеры). Понижение температуры (45-60 C), для прикрепления праймеров к одноцепочечным цепям ДНК;
Удлинение (синтез новой ДНК). Начинается с отожженного праймера и проходит вдоль цепи ДНК (72C).

После завершения первого цикла процесс повторяется, возвращаясь к первичной температуре, и начинается следующий цикл денатурации, отжига и удлинения (автоматического процесса в термоциклере). Этому трехступенчатому температурному циклу предстоит повторяться около тридцати раз, что приведет к экспоненциальной амплификации последовательности целевого гена.

Поскольку этапы с первого по третий повторяются в несколько циклов, с каждым из них образуются вновь выстроенные цепи ДНК, отсюда и название этой лабораторной процедуры.

Анализ новообразованных цепочек ДНК

В конце, по завершении циклов цепной реакции, так называемые продукты ПЦР-анализа, то есть новообразованные молекулы ДНК, исследуют и оценивают качественно и количественно. Есть много вариантов этой оценки, в основном основанные на окрашивании (как правило, флуоресцентным красителем) ДНК и визуализации (с помощью гель-электрофореза или фотометрического флуоресцентного обнаружения).

Какие результаты анализов дает ПЦР

Результаты современных методов лабораторного исследования можно объединить в две группы:

качественные результаты;
количественные результаты.

Качественная методика выявляет, присутствует ли определенный участок генетического материала в исследуемом материале («положительный» результат) или нет («отрицательный» результат).

Таким образом, качественная ПЦР в основном используется для уточнения следующих диагностических вопросов (результаты «да/нет»):

диагностика наследственных заболеваний;
уточнение мутаций;
распознавание генетических характеристик (например, предрасположенность к определенным заболеваниям) и т.д.

Количественная ПЦР — дальнейшее развитие лабораторной процедуры. С помощью нее выявляется не только наличие определенного участка генетического материала, но и количество генетического материала. Соответственно, количественная ПЦР используется для определения количества возбудителей в организме больного. При вирусных инфекциях эта процедура используется для выявления вирусной нагрузки.

Кроме того, количественная лабораторная оценка также имеет большое значение в фундаментальных исследованиях, благодаря чему эта диагностика приносит пользу не только медицине человека, но и ряду других научных областей: ветеринарии, биохимии, биологии и многим другим.

Преимущество этого анализа в диагностике инфекционных заболеваний состоит в том, что результаты лабораторной процедуры становятся доступны достаточно быстро (как правило, в течение одного рабочего дня). Кроме того, это тестирование считается высокочувствительным лабораторным методом. Это означает, что даже минимальное количество бактерий или вирусов в исследуемом материале приводит к достоверно положительному результату.

Наиболее важные области применения ПЦР

Что касается областей применения в области медицины человека, то этот лабораторный тест используется для решения следующих диагностических вопросов:

Выявление наследственных заболеваний. Процедуры проводятся для диагностики большого количества наследственных заболеваний;
Фармакогенетика. Исследуя генетические особенности метаболизма печени, можно сделать выводы об эффективности и дозировке препаратов.
Онкологические заболевания. Метод используется, с одной стороны, для уточнения факторов риска некоторых опухолевых заболеваний (например, рака молочной железы). Однако, с другой стороны, клетки и ткани в уже возникших опухолях также можно исследовать на предмет различных мутаций, что играет все более важную роль в лечении этих заболеваний.
Судебная медицина («судебная экспертиза»). В этом случае применение ПЦР тестирования имеет большое значение, например, в процедурах установления отцовства.
Инфекционная медицина. ПЦР имеет огромное значение в диагностике и мониторинге течения и терапии бактериальных, вирусных и паразитарных инфекционных заболеваний.
Секвенирование ДНК. Это процесс определения последовательности нуклеотидов (пар оснований) определенной последовательности ДНК. Клинически секвенирование используется для выявления патогенных мутаций у лиц с генетическими нарушениями, вызванными редкими вариантами в определенном локусе. Примером может служить повторное секвенирование локуса BRCA1 у лиц с риском семейного рака молочной железы. Текущее клиническое секвенирование основано на ПЦР, при этом каждый анализ фокусируется на определенном экзоне или области гена.
Обнаружение редких последовательностей. Технология также позволяет обнаруживать редкие последовательности в популяции молекул ДНК или РНК. Это особенно полезно при поиске перестроек ДНК в условиях неоплазии. Примером может служить открытие того, что вирус, родственный Herpes simplex, участвует в патогенезе саркомы Капоши.

Продолжение статьи

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 1.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 2.

Источник

Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules Part A

PCR Amplification of Tandemly Repeated Oligonucleotides

Reagents

Equipment

Procedures

Marine Enzymes and Specialized Metabolism — Part A

4.2.3.3 Amplification of Au8003 and Au6298

POLYMERASE CHAIN REACTION

Biochemical Components

DNA polymerase

Oligonucleotide primers

Deoxynucleoside triphosphates

Buffer components

Odorant Binding and Chemosensory Proteins

7.1 Protocol

7.1.1 First PCR

7.1.2 Purification of the PCR product

7.1.3 Second PCR

7.1.4 Digestion with DpnI

7.1.5 Transformation of DH5α E. coli cells

7.1.6 Analysis of colonies

Ribonucleases — Part B

B Enzymes and Cloning Procedures

DNA and Aspects of Molecular Biology

7.18.4.3 The Polymerase

Enzymology at the Membrane Interface: Intramembrane Proteases

3.3.1 Materials and Equipment

Directed Evolution Tools in Bioproduct and Bioprocess Development

2.2.3 Random Chimeragenesis on Transient Templates (RACHITT)

RNA Turnover in Eukaryotes: Analysis of Specialized and Quality Control RNA Decay Pathways

5.3 Polymerase chain reaction

RNA Modification

2.2.2 Protocol

Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules Part A

PCR Amplification of Tandemly Repeated Oligonucleotides

Reagents

Equipment

Procedures

Marine Enzymes and Specialized Metabolism — Part A

4.2.3.3 Amplification of Au8003 and Au6298

POLYMERASE CHAIN REACTION

Biochemical Components

DNA polymerase

Oligonucleotide primers

Deoxynucleoside triphosphates

Buffer components

Odorant Binding and Chemosensory Proteins

7.1 Protocol

7.1.1 First PCR

7.1.2 Purification of the PCR product

7.1.3 Second PCR

7.1.4 Digestion with DpnI

7.1.5 Transformation of DH5α E. coli cells

7.1.6 Analysis of colonies

Ribonucleases — Part B

B Enzymes and Cloning Procedures

DNA and Aspects of Molecular Biology

7.18.4.3 The Polymerase

Enzymology at the Membrane Interface: Intramembrane Proteases

3.3.1 Materials and Equipment

Directed Evolution Tools in Bioproduct and Bioprocess Development

2.2.3 Random Chimeragenesis on Transient Templates (RACHITT)

RNA Turnover in Eukaryotes: Analysis of Specialized and Quality Control RNA Decay Pathways

5.3 Polymerase chain reaction

RNA Modification

2.2.2 Protocol

Процедура приготовления реакционной смеси

Праймеры

Дезоксинуклеозидтрифосфаты

Pfu- ДНК полимераза

Предотвращение упаривания реакционной смеси

Условия термоциклирования

Завершающая стадия синтеза

Литература

ДНК-полимераза Pfu — Pfu DNA polymerase

История

Рекомендации

внешняя ссылка

Реактивы для молекулярной биологии на каждый день: на складе по специальным ценам!

Дезоксинуклеотидтрифосфаты dATP, dCTP, dGTP, dTTP, смесь, 2 мМ каждого

Реагент для стабилизации РНК и хранения образцов RNAlater
(аналоги арт. 3787.0100, 3787.0250, Диаэм)

Ингибитор РНКаз Ribolock, 40 ед/мкл
(аналоги арт. 3784.2000, арт. 3784.10000, Диаэм)

Вода без нуклеаз, обработанная диэтилпирокарбонатом
(аналоги арт. 3783.0005, 3783.0050, Диаэм)

ТРИзол — реагент для выделения РНК, ДНК и белков
(аналоги арт. 3789.0100, арт. 3789.0250, Диаэм)

Среда для кариотипирования PB-MAX (1x), жидкая
(аналог Лимфокар-2, арт. H10, Россия; Амниокар, арт. H211, Россия)