Ошибки при постановке пцр

Команда «Биокор Текнолоджи» разрабатывает тест-системы и наборы для молекулярной диагностики методом ПЦР, и расскажет в этом материале, на какие детали стоит обратить внимание для предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

ПЦР является универсальным методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать даже не собственно вирус или бактерию в биологическом материале, а участки их РНК или ДНК.

Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 копиям генетического материала возбудителя на реакцию. Для сравнения, если человек находится в активной фазе развития заболевания, то его биологический материал содержит миллионы геномов возбудителя на миллилитр, что, после выделения нуклеиновой кислоты будет равно нескольким тысячам копий на реакцию.

В мире, и в Украине в частности, с начала эпидемии COVID-19 ведутся дискуссии относительно того, насколько надежной является такая методика. Одни источники говорят, что ошибочным может быть каждый четвертый тест, другие указывают, что количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет лишь несколько процентов. Учитывая актуальность темы, рассмотрим на примере ПЦР для диагностики COVID-19 по каким причинам могут возникать сомнительные или ошибочные результаты. Большинство указанных аспектов имеет место и в случае с ПЦР-тестированием других инфекционных заболеваний человека.

Особенности выбора места для взятия биологического материала

Такие возбудители, как SARS-CoV-2, способны поражать значительное количество органов. Для исследования на COVID-19 обычно берутся мазки из горла или носоглотки, где возбудитель в большом количестве находится ограниченное время — на 5-10 день от начала инфицирования, далее он спускается ниже — к бронхам и легким. Поэтому отрицательный результат ПЦР-теста не может исключать факта инфицирования пациента COVID-19.

С одной стороны, риски получить ложноотрицательный результат ПЦР-теста несколько возрастают на 1-7 день от начала инфицирования, когда количество вируса мало, а также на 10-30 день, когда, во-первых, COVID-19 уже «ушел» ниже, и, во-вторых, в организме уже присутствуют в достаточном количестве антитела, и размножение вируса более или менее эффективно сдерживается иммунной системой. С другой стороны, в некоторых случаях, мы можем получить сомнительно положительный результат ПЦР-теста даже на 60-й день от начала инфицирования, когда человек уже переболел, но в ее биологическом материале все еще можно найти обломки вируса. Все вышесказанное касается только некоторых отдельных случаев и не имеет характера «абсолютной закономерности».

Алгоритм тестирования регламентирован на государственном уровне и, если существует обоснованное подозрение на инфицирование COVID-19, для уточнения диагноза могут проводить ПЦР-анализ повторно.

Неправильное взятие биологического материала

Во избежание ложноположительных результатов вследствие загрязнения — попадание молекул ДНК/РНК из внешней среды, — клинический материал необходимо отбирать стерильными одноразовыми инструментами в одноразовые стерильные пробирки согласно установленным стандартам МОЗ. Взятие материала должны проводить медицинские работники, одетые в средства индивидуальной защиты.

Недостаточное количество биологического материала может привести к ложноотрицательным результатам исследования. В некоторых случаях, эту проблему можно отследить на этапе выделения нуклеиновых кислот или в процессе амплификации (при условии использованием в диагностических наборах для обнаружения SARS-CoV-2 внутреннего контроля, то есть фрагмента генома человека).

Несоблюдение температуры и сроков хранения

Учитывая возможность распада РНК в клиническом материале, сроки хранения и транспортировки должны быть минимальными. В идеальном случае все мазки нужно транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия в специальном транспортной среде при температуре плюс 4 °C. Транспортная среда должна содержать специальные реагенты — муколитики, обеспечивающие разрушение слизи, которая подавляет ПЦР. Если отсутствует возможность своевременно доставить образцы материалов в лабораторию, их можно замораживать до минус 70 °C, используя для этого твердую углекислоту — «сухой лед». Образцы можно хранить в лаборатории в течение недели при температуре минус 20 °C, или до месяца при температуре минус 70 °C. Критическим моментом является количество замораживаний/размораживаний образца: чем их больше, тем ниже качество образца и, вследствие этого, и чувствительность метода в целом.

В результате нахождения образцов в транспортной среде больше срока, рекомендованного производителем, происходит рост естественной бактериальной микрофлоры, которая обычно находится в ротовой полости человека, и разрушение молекул вирусной РНК в образце. При использовании специальных консервантов и стабилизаторов, биоматериал может храниться в температурном диапазоне в соответствии с инструкцией производителя сроком до месяца.

Выделение нуклеиновых кислот

ПЦР-исследование не проводится непосредственно на биологических образцах и требует предварительной пробоподготовки. На этом этапе большое значение имеет качество наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые должны обеспечить выделение образца соответствующей концентрации и степени очистки от примесей, подавляющие ПЦР. Из-за неправильного выбора набора также может быть потеряна часть или даже все РНК возбудителя, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Качество и чистоту нуклеиновых кислот можно проверить с помощью специального аналитического прибора — спектрофотометра. Он есть во многих лабораториях, осуществляющих ПЦР-исследования.

Выделенную из образцов РНК можно хранить при температуре минус 20 °C до недели. Для более длительного хранения нужна температура минус 70 °C. Также можно использовать специальные реагенты, стабилизирующие РНК и предупреждают ее деградации (например, DEPC — диэтилпирокарбонат).

Амплификация

Процесс амплификации (увеличение копий участков ДНК, которые обычно содержат необходимые фрагменты целевых генов) может включать до 45 циклов, во время каждого из них количество копий удваивается. Он обеспечивается реагентами, которые входят в диагностические наборы для выявления SARS-CoV-2, и приборами, обеспечивающими циклическую смену температур — амплификаторами.

Для обеспечения корректных результатов, качество диагностических наборов является первоочередным требованием. Также лаборатории должны проводить процедуру их верификации, проведя сравнительные испытания с собственными панелями референтных образцов и решениями от других производителей. Наборы должны поступать в лаборатории в термобоксах с холодовыми блоками и храниться при температуре минус 20 °C. Несоблюдение условий их транспортировки или хранения приводит к повреждению компонентов наборов, и, вследствие того, к ложноотрицательным результатам. Чтобы предупредить эту ошибку, в состав каждого диагностического набора входит положительный контрольный образец, задачей которого является установление работоспособности реагентов.

Диагностические наборы должны быть совместимыми с амплификаторами, используемыми в лаборатории. Реагенты, входящие в состав набора, меченные различными флуоресцентными красителями. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном диапазоне (на определенном «канале»). Если прибор имеет слабую чувствительность по определенным флуоресцентным каналам, это может приводить к ошибочным результатам. Во избежание ошибок работники лабораторий должны проверять исправность работы приборов, а также настройки параметров работы и протоколов амплификации.

Контаминация образцов

При несоблюдении мер безопасности в помещениях лаборатории могут накапливаться продукты амплификации. Это приводит к контаминации образцов, и, в общем итоге, к ложноположительным результатам. Для подтверждения отсутствия загрязнения, каждую серию ПЦР-исследований нужно сопровождать постановкой негативных контрольных образцов, включенных в состав диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Перекрестная контаминация может возникать из-за попадания аэрозольных частиц от соседнего образца, содержащего вирусную РНК, при внесении образцов в ПЦР-смесь. На этапе амплификации контаминированный образец издает слабый положительный результат, который означает, что в исследуемой пробе обнаружено очень малое количество вируса. Но такой результат также может указывать, что человека тестировали до наступления полного выздоровления и уровень вируса в его организме был низким.

Способы предупреждения контаминации — использование наконечников с фильтрами, химическая и ультрафиолетовая дезинфекция всех рабочих поверхностей, наличие отдельных наборов дозаторов, оборудования, халатов и перчаток для каждой зоны, проведения внутрилабораторного и внешнего контроля качества исследований — регламентированы на государственном уровне.

Другими эффективными, однако дорогостоящими мероприятиями для предотвращения контаминации является автоматизация этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации, а также двойной контроль — постановка каждого образца в двух параллельных реакциях.

Ошибки обработки данных

Расчеты результатов ПЦР в реальном времени проводятся с использованием компьютерных программ. Амплификатор в автоматическом режиме измеряет интенсивность флуоресценции в образцах на каждом цикле. Кривая амплификации имеет так называемую фазу экспоненциального роста, после которой следует фаза плато. Автоматическая интерпретация результатов не всегда дает правильный результат, поэтому рекомендуется проводить анализ кривых амплификации на предмет пересечения пороговых значений, и корректировать задачи пороговых значений по мере необходимости. Для большей достоверности можно сравнить такую ​​сомнительную кривую с кривой подтвержденного положительного образца.

Подытожим

На каждом этапе исследования являются условия, несоблюдение которых может привести к недостоверным результатам. Некоторые из потенциальных ошибок являются общими для большинства видов лабораторной диагностики (например, ошибки при взятии и хранения образца, настройка оборудования), тогда как другие являются специфическими только для этого вида исследования (например, контаминация образцов, низкое качество выделенных нуклеиновых кислот).

ПЦР — многостадийный метод, и для получения максимально достоверных и воспроизводимых результатов необходимо надлежащее выполнение каждого этапа процесса в соответствии со стандартами МОЗ и инструкциями производителей. Вторым важным условием является качество всех реагентов и расходных материалов, используемых в ПЦР: систем для сбора биологических материалов, наборов для выделения нуклеиновых кислот, диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Полимеразно-цепная реакция, пожалуй, один из самых чувствительных и наиболее точных методов диагностики различных инфекционных заболеваний, особенно, передающихся половым путем. Определяя даже незначительное количество частиц ДНК бактерий, вирусов, грибов, ПЦР является и достаточно специфичным методом, редко дающим ложноположительные результаты.

Ложноположительный результат означает, что на самом деле инфекции нет, а реакция положительная.

Но, даже имея 98-99% точности, при ПЦР иногда также бывают неверные ответы, которые практически никогда не связаны с самой реакцией, а больше с нарушениями на предварительном этапе.

Причины ложноположительного результата анализа ПЦР:

• Не выдержаны сроки для проведения контрольных анализов после лечения половых инфекций. Дело в том, что большинство инфекций находятся внутри клеток или фиксированы на поверхности их мембран. Во время полноценного лечения возбудитель ИППП погибает, но частицы его генома (ДНК) остаются еще некоторое время в организме хозяина. Нужно время, порядка 3 недель, чтобы эти клетки заменились на новые, не контактировавшие с инфекционным агентом, тогда и берется контроль. Если же взять анализ раньше, то, благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР определит ДНК уже погибших бактерий и укажет на наличие возбудителя, что будет являться ложноположительным, так как инфекция уже погибла.
  Наши врачи обладают достаточными знаниями в области диагностики ЗППП и выдерживания сроков, поэтому такие ситуации в клинике Частная практика исключены.
• Попадание ДНК инфекций, передающихся половым путем, в пробирку с рук венеролога, с перчаток и урологических зондов.
  Данный фактор исключен, так как для забора материала используются только одноразовые перчатки, пробирки и зонды.
• Крайне редко встречаются ложноположительные результаты при наличии в соскобе близкородственных микроорганизмом. То есть анализатор выдает наличие патогенной бактерии, вызывающей венерическое заболевание, а на самом деле это компонент нормальной микрофлоры. Но эта проблема уже давно решена внедрением более современных и специфических тест-систем.
• Контаминация или занесение ДНК инфекций в пробирку на лабораторном этапе исследования тоже был когда то возможен, но практически исключен правильной организацией процесса диагностики и обучением персонала.

В любом случае диагноз ставится всегда не только на основании результатов одного анализа. Окончательный диагноз заболевания, передающегося половым путем, это совокупность жалоб, клинического осмотра и комбинации различных лабораторных и инструментальных методов.

Если у уролога, гинеколога или венеролога появляются сомнения в правильности полученных результатов ПЦР или выявляется несоответствие имеющейся клинической картины и данных лабораторной диагностики между собой, то врач всегда порекомендует дообследование с применением методов ИФА, НАСБА, посевов, с целью уточнения ситуации.

В наших клиниках есть все доступные современной медицине методики обследования мужчин и женщин. Поэтому установление ложных диагнозов ИППП исключено.

Врач клиники «Частная практика» дерматовенеролог, уролог Волохов Е.А. рассказывает об анализе ПЦР на инфекции.

Real-Time PCR: Как избежать ошибок

Ключевые факторы, оценка значения C_T, применение на практике

ПЦР в реальном времени (также известна как количественная ПЦР, real-time PCR, или qPCR) является простой и эффективной методикой количественного определения целевой последовательности ДНК в образцах. Зачастую, по причине крайней простоты освоения и выполнения данной методики, некоторые факторы, оказывающие критическое влияние на успешность метода, остаются без внимания. В этом обзоре мы рассмотрим ключевые факторы, которые необходимо учитывать при подготовке и интерпретации результатов real-time PCR.

Факторы, влияющие на C_T

C_T-величина (англ. Threshold cycle – пороговый цикл) – это значение количества циклов реакции, при котором кривая амплификации и прямая порога чувствительности прибора пересекаются (рис. 1B). Это значение является относительным показателем содержания ДНК-матрицы в образце, так как различия в количестве молекул матрицы в начале реакции влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума. Кроме того, на абсолютное значение C_T влияет множество других факторов, которые не зависят от изначального количества ДНК-матрицы в реакции. В данной статье мы обсудим самые часто встречаемые факторы, влияющие на значение C_T и выясним, как правильно оценивать эффективность прохождения real-time PCR.

На рисунке 1 изображены некоторые параметры кривой амплификации. Экспоненциальная фаза на рисунке 1B соответствует линейной фазе кривой на рисунке 1C. На рисунке 1C пороговое значение должно пересекать линейный участок кривой амплификации. Значение C_T обратно пропорционально количеству ДНК-матрицы в реакции, то есть чем меньшее количество ДНК-матрицы находится в реакционной смеси, тем большее количество циклов необходимо для достижения порогового количества продукта амплификации. Однако любые изменения в составе реакционной смеси или настройках детектора флуоресценции могут оказывать влияние на значение C_T. Соответственно, значение C_T для реакций, которые были проведены при разных условиях или в которых были использованы разные реактивы, не могут быть непосредственно сравнены друг с другом.

Рисунок 1:  A: Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя. Другими словами, Rn – это репортерный сигнал, нормализованный к сигналу ROXÔ. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение Rn.

B: Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение ΔRn.

C: График кривой амплификации представлен в виде логарифмической функции Log(ΔRn) от номера цикла.

Влияние компонентов реакционной смеси

Интенсивность флуоресценции каждой молекулы зависит от внешних факторов, к ним относятся, например, pH или концентрации солей в реакционной смеси. На рисунке 2 изображён график флуоресценции зонда TaqMan® в двух различных реакционных смесях. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции в реакционной смеси A выше, несмотря на одинаковую концентрацию ДНК-матрицы, зонда и красителя ROX™ в обеих смесях.

Рисунок 2: Пики флуоресценции, полученные при анализе двух разных реакционных смесей с одинаковым количеством ROX™. Различия в значении сигналов обусловлено составом реакционных смесей. На этом рисунке ось X отображает длину волны флуоресценции, ось Y – интенсивность свечения флуорофора.

В результате, значение ΔRn будет различным, это отображено на рисунке 3. Обратите внимание, что базовые линии для двух реакционных смесей различны (рисунок 3А). Различие в значении C_T не отображает общую производительность реакционной системы (рисунок 3B). Реакционные смеси с эквивалентными показателями чувствительности могут иметь различные абсолютные значения C_T.

На рисунке 3 в реакционных смесях A и B была проведена амплификация гена РНКазы P человека. В обеих образцах было использовано одинаковое количество геномной ДНК. На рисунке 3A показана зависимость Rn от номера цикла и базовые линии для обеих реакций. На рисунке 3B показана зависимость значения Log (ΔRn) от номера цикла. Значение порога чувствительности (зеленая прямая) одинаково для обеих реакций. Пороговый цикл C_T для реакционной смеси B (C_TB) наступает раньше, чем для реакционной смеси A (C_TA) при одинаковом количестве ДНК-матрицы в обеих образцах.

Пассивный референтный краситель ROX™

Величина Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции красителя FAMÔ к  флуоресценции красителя ROX. Таким образом, если концентрация красителя ROX будет меньше, а концентрация FAM останется неизменной, величина Rn будет выше. Это приведет к тому, что значение базовой линии станет выше, и вследствие этого, ΔRn будет меньше, что в конечном итоге приведет к другому значению C_T. Различие в значениях C_T при уменьшенных концентрациях ROX не является показателем увеличения чувствительности реакции, при этом могут появиться другие нежелательные последствия. Низкая концентрация ROX в реакционной смеси может привести к увеличению стандартного отклонения значения C_T, как показано на рисунке 4. Чем больше стандартное отклонение, тем менее достоверны данные, особенно если есть необходимость детектировать небольшие различия концентрации целевой последовательности ДНК. (Более подробно это описано в разделе Точность).

На Рисунке 4. В трех реакционных смесях с различным содержанием ROX™ была проведена амплификация Трансформирующего ростового фактора бета (TGF beta). На рисунке 4A изображено значение C_T, на рисунке 4B изображено стандартное (среднеквадратическое) отклонение. Чем меньше концентрация ROX, тем раньше наступает пороговый цикл, но это увеличивает стандартное отклонение.

Эффективность ПЦР

Степень эффективности полимеразной цепной реакции тоже влияет на величину C_T. Сравнивая серии разведений, амплифицированых в условиях низкой и высокой эффективности реакции, мы обнаружим, что кривые амплификации имеют разный угол наклона. На рисунке 5, два образца (X и Y), амплифицированые в условиях низкой и высокой эффективности реакции, показывают различные значения C_T при одной и той же концентрации ДНК-матрицы. В этом примере, кривая амплификации при высокой эффективности реакции (синий график на рисунке 5) дает более низкое значение C_T при высокой концентрации ДНК-матрицы, хотя она имеет более высокую чувствительность при низкой концентрации ДНК-матрицы.

Рис. 5. Синяя стандартная кривая отображает 100% эффективность реакции (наклон -3,3). Зеленая стандартная кривая отображает 78% эффективность реакции (наклон -4). При амплификации Y молекул ДНК-матрицы в условиях низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает раньше, чем в условиях высокой эффективности реакции. При меньшем количестве молекул ДНК-матрицы происходит наоборот – при низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает позже, чем в условиях высокой эффективности реакции.

Эффективность ПЦР зависит от типа анализа, качества реакционной смеси и качества ДНК в образце. Как правило, эффективность реакции 90-110% считается приемлемой.

Различие в значении C_T для двух образцов может достоверно свидетельствовать о различной концентрации ДНК-матрицы в этих образцах только при условии одинаковых настройках оборудования, реактивов и типа анализа. Однако, если анализ был проведен на разном оборудовании, были использованы разные реактивы, праймеры или зонды, либо реакции проводились в разных объемах – различия в значениях C_T не дадут нам достоверной информации. Следовательно, абсолютные значения C_T имеет смысл сравнивать только в том случае, если все условия реакции были абсолютно одинаковыми.

Как оценить эффективность ПЦР в реальном времени

В случае, если какие-либо условия эксперимента были изменены (например, анализ проводился на разном оборудовании или в разных реакционных смесях), необходимо учитывать следующие параметры.

Динамический диапазон

 Для того, чтобы точно оценить эффективность реакции, необходимо провести, как минимум, 3 повторения реакции при концентрации ДНК-матрицы 5 log (10⁵ копий ДНК-матрицы на образец). Причина такой необходимости проиллюстрирована на рисунке 6. На нем отображено изменение угла наклона графика зависимости величины C_T при различных градиентах разведения ДНК-матрицы (1 log и 5 log). То есть, если мы будем проводить тестирование серии разведений при концентрации 1 log, и получим показатель 100% эффективности реакции, в реальности, разброс данного показателя будет находится в диапазоне 70-170%. Делая тот же самый тест при концентрации ДНК-матрицы 5 log, потенциальный разброс будет составлять всего ± 8%. То есть, если мы получили значение, например, 94% эффективности (при концентрации 5 log), то действительная эффективность реакции будет в диапазоне 88-100%. Из этого можно сделать вывод, что определять эффективность реакции необходимо при концентрации ДНК-матрицы 5 log. Уклон графика -3,3 ± 10% свидетельствует о 100%  ± 10% эффективности полимеразной цепной реакции. Более низкие значения эффективности ПЦР свидетельствуют о низкой чувствительности метода при данных условиях.

На Рисунке 6 точный расчет эффективности реакции, сделанный на основе серии разведений ДНК-матрицы. Для двукратного разведения на 5 точках (оранжевый) потенциальный разброс значений выше, чем для десятикратного разведения на 5 точках (синий).

Значение R²

Еще одним параметром, без которого невозможно точно рассчитать эффективность реакции, является коэффициент детерминации (R²). В математической статистике этот параметр показывает, насколько точно мы можем спрогнозировать значение некой величины, зная другую. Если R²=1, тогда можно точно установить корреляцию величины X (количество ДНК-матрицы) к Y (значению C_T) (рисунок 7A). Если R²=0, тогда невозможно определить корреляцию величины X к величине Y (рисунок 7B). Значение R²>0,99, в целом, обеспечивает достаточную точность определения корреляции.

На Рисунке 7 пример расчета R² для двух прямых. A: между x и y нет прямой корреляции. B: между x и y есть прямая корреляция.

Точность

Наиболее используемым способом расчета точности метода является вычисление стандартного отклонения (квадратный корень из вариансы). Если множество результатов имеют небольшой разброс относительно средней величины, тогда стандартное отклонение имеет малое значение, если же разброс велик, то стандартное отклонение больше.

На практике, большая выборка представляет собой распределение, близкое к нормальному. Это следствие центральной предельной теоремы, она гласит, что суммы многих независимых, одинаково распределенных случайных величин стремятся к нормальному распределению как к пределу. На рисунке 8А значения распределены таким образом, что 68% из них находятся в пределах одного стандартного отклонения, 95% – в пределах 2 стандартных отклонений, и 99,7% находится в пределах 3 стандартных отклонений.

Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (рисунок 8B). Для того чтобы определить количество ДНК-матрицы в диапазоне двукратных разведений в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,167. Чем больше стандартное отклонение, тем меньше вероятность достоверно найти разницу между образцами. Чтобы найти разницу между образцами в диапазоне двукратных разведений в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,250 (рисунок 8C).

На Рисунке 8 нормальное распределение и стандартное отклонение.  На рисунке (A) показано нормальное распределение результатов анализа. Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (образцы X и Y). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 6 стандартных отклонений (1/6=0.167), как показано на рисунке (B). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 4 стандартных отклонений (1/4=0.25), как показано на рисунке (C).

Чувствительность

Любая из современных систем ПЦР в реальном времени достигла такого уровня чувствительности, что стало возможно детектировать единичную копию ДНК-матрицы в образце. Чувствительность не зависит от абсолютного значения C_T.

Как было сказано ранее, ключевым фактором для расчета чувствительности метода является эффективность реакции (рисунок 5). Другим важным моментом, связанным с детекцией малого количества копий ДНК является то, что распределение ДНК-матрицы будет отличаться от нормального. Вместо этого, оно будет стремиться к распределению Пуассона: то есть, если мы имеем большую выборку повторений, в каждом из которых, в среднем, по одной копии ДНК-матрицы, то, согласно распределению, в 37% образцов не будет ни одной копии, 37% будут иметь одну копию, а 18%  – по две копии ДНК-матрицы (см. рисунок 9). Следовательно, для того, чтобы обеспечить достаточную достоверность детекции малого количества ДНК, необходимо проводить достаточное количество повторений, для того, чтобы обойти ограничения, связанные с распределением Пуассона.

Вывод

Вышеописанные факторы: эффективность реакции, R², точность и чувствительность метода необходимо учитывать при сравнении результатов ПЦР анализа при различающихся условиях реакции. Для более точных результатов сравнения, все факторы, указанные в табл. 1 должны быть учтены вместе.

Вместе с тем, дополнительные виды контроля, такие как NTC (отрицательный контроль), no RT-контроль (контроль без обратной транскрипции) и контроль качества ДНК должны быть проведены для каждого анализа.

Попробуем применить полученные знания на примере.

В фермерском хозяйстве выявили нескольких животных с симптомами африканской чумы. Как известно, заболевание это очень «коварно»: оно может проходить как и остро, так и бессимптомно. Из-за этого болезнь распространяется крайне непредсказуемо, что чревато потерей всего поголовья свиней.

Африканская чума свиней – это вирусное заболевание. Особенностью любых вирусных заболеваний является то, что в организме хозяина вирус представлен не только в виде отдельных возбудителей-вирионов, но также и в виде молекул вирусной ДНК.

Все классические методы диагностики – патологоанатомические, иммунологические и т.п. являются косвенными, и иногда невозможно своевременно выявить носителей вируса в во время инкубационного периода или бессимптомного течения болезни. В таком случае, ПЦР-диагностика является наиболее точным, чувствительными и высокоспецифичным методом диагностики. Кроме того, благодаря особенностям Real-time PCR возможно определить количественное содержание вируса у отдельно взятого животного.

Для проведения ПЦР-исследования необходимо отобрать биологический материал – это может быть как и кровь, так и ткани внутренних органов. Далее, проводят выделение и очистку ДНК.

Подготовка образцов

Выделение ДНК в общем случае проводят путем разрушения (лизиса) клеток, содержащихся в образце (тем самым, высвобождая в том числе и вирусную ДНК) и очистке полученного лизата от белков, жиров и углеводов. Обеспечивается это обработкой образца поверхностно-активными веществами (например, SDS) или хаотропными агентами (напр. гуанидилтиоцианатом) в присутствии протеиназ. Далее, ДНК пререносят на носитель: к лизату добавляют суспензию ионообемнных шариков, или же его пропускают через ионообменную мембрану, на которые специфически «налипают» молекулы ДНК. Носитель с прикрепленными к нему молекулами ДНК отмывают от клеточного дебриса, после чего элюируют («открепляют») ДНК, с помощью растворителя с низкой ионной силой, чаще всего MQ-водой. На выходе получается высокоочищенный раствор ДНК, пригодный для проведения анализа.

Амплификация

На этапе ПЦР необходимо подобрать специфическую для данного возбудителя пару праймеров – они должны обеспечить амплификацию уникального для данного вируса гена/локуса. В случае, если проводят Real-time PCR, возможно определить количество ДНК вируса в образце. Однако, для того, чтобы оценка количества ДНК вируса была достоверна, необходимо соблюсти ряд условий:

Для анализа необходимо отобрать одинаковый тип и количество биоматериала у всех больных или «подозрительных» животных;

• Забор материала должен быть произведен в одно и то же время;
• Выделение ДНК из образцов должно производиться одновременно и одним и тем же методом (набором реактивов);
• ПЦР для всех образцов необходимо проводить в одинаковых реакционных смесях, на одном и том же приборе;
• Если все образцы невозможно проанализировать за один прогон, протокол анализа на приборе должен быть одним и тем же для всех образцов.

Только при соблюдении всех условий возможно получить достоверные данные.

Если же важно установить только факт наличия возбудителя заболевания у животного, данные условия не обязательны.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Кривая амплификации
Кривая амплификации показывает зависимость флуоресценции репортерного красителя от номера цикла. Реакции различаются по времени, когда возможно обнаружить продукты амплификации. Чем больше изначальное количество ДНК-матриц в исследуемом образце, тем раньше возникнет достаточная для детекции флуоресценция.

Базовая линия
Во время начальных циклов реакции наблюдаются фоновые флуоресцентные сигналы. В соответствие с этим фоном необходимо настроить значение базовой линии.

Дельта Rn
Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии.

Референтный краситель
Краситель, который создает внутреннюю референтную флуоресценцию, по отношению к которой можно нормализировать репортерную флуоресценцию. Нормализация необходима для того, чтобы скорректировать флуктуации, связанные с различиями концентраций компонентов реакционной смеси, объема и особенностей образца.

Эффективность ПЦР
Следующая формула описываю прохождение ПЦР:
Cn=Ci*(1+E)n , где
Ci – начальное количество ДНК-матрицы,
Cn – количество ампликонов на цикле n,
n – количество циклов,
E – эффективность данной реакции.
Если эффективность максимальная (=1), тогда формула приобретет вид Cn=Ci*2n, при этом количество продуктов реакции (ампликонов) будет увеличиваться в 2 раза с каждым циклом. Если эффективность ниже, то каждый цикл ампликоны будут синтезироваться в меньшем количестве, что отобразиться на кривой амплификации. Оптимальная эффективность – от 90 до 110%.

Репортерный краситель
Репортерный краситель связан с 5’-концом зонда TaqMan®. При гибридизации зонда с ДНК-матрицей, этот краситель дает флуоресцентный сигнал, сигнализирующий об успешной гибридизации. Если используется краситель SYBR® Green , то сигнал последует при интеркалляции красителя в двухцепочечеую ДНК, что свидетельствует об успешной амплификации. Специфичность связывания с целевой последовательностью ДНК необходимо проверить по кривой плавления продуктов реакции, либо на гель-электрофорезе.

Rn
Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя.

Пороговое значение (пороговая линия, порог чувствительности)
Это значение ΔRn для CT в данном виде анализа. Порог чувствительности настраивается таким образом, чтобы он был выше базовой линии, но при этом кривая амплификации должна пересекать его в самом начале экспоненциальной фазы.

Пороговый цикл (CT)
Цикл, во время которого кривая амплификации пересекает пороговое значение.

Ложноположительные серологические реакции на сифилис (ЛПР) – это положительные реакции у людей, которые никогда не болели и в момент обследования не болеют сифилисом. То есть специфической инфекции в организме нет и не было, а серологические реакции дают положительный результат.

Ложноположительными, или неспецифическими результатами называют положительные результаты серологических реакций на сифилис у лиц, не страдающих сифилитической инфекцией, и не болевших сифилисом в прошлом.

Ошибочный анализ на сифилис из-за технических причин

ЛПР могут быть обусловлены техническими погрешностями и ошибками при выполнении исследований, а также качеством реагентов. Несмотря на многочисленные достоинства диагностикумов для РПГА, ИФА и РИФ и их модификаций, применяемых для диагностики сифилиса, в отдельных случаях отмечаются недостоверные результаты анализов. Это может быть связано как с недостаточным уровнем квалификации и профессиональной ответственности персонала (так называемые небиологические или технические ошибки), так и с особенностями тестируемых образцов (биологические ошибки).

Ошибки небиологического характера могут возникать на любом этапе проведения исследований: преданалитическом, аналитическом, и постаналитическом т.е. при заборе, транспортировке, хранении биоматериала, использовании хилезной, проросшей сыворотки, при неоднократном замораживании и оттаивании тестируемых образцов, а также при использование диагностикумов с истекшим сроком годности и т.д. В частности, несоблюдение условий и сроков хранения диагностических наборов является причиной снижения чувствительности реакции и получения ложноотрицательных результатов.

Ложноположительные результаты может вызвать контаминация сывороток пациентов, серонегативных в отношении бледной трепонемы, следами сывороток серопозитивных лиц, что может иметь место при приготовлении сывороток.

Существует множество других технических ошибок, приводящих к получению недостоверных (ложноотрицательных и ложноположительных), сомнительных результатов исследования. В некоторых лабораториях не осуществляется внутри- и внешнелабораторный контроль качества исследований на сифилис, что ведет к получению диагностических ошибок и неуверенности врачей-лаборантов в результатах анализа.

Источником ошибок при постановке неспецифических тестов могут быть неиспользование контрольных сывороток, неравномерная концентрация антигена в опыте из-за недостаточного перемешивания ее перед использованием, контаминация образцов и посуды микроорганизмами, нарушение сроков и условий хранения компонентов реакции, нарушение техники взятия крови.

В современных тест-системах в качестве антигена нашли применение рекомбинантные или синтетические пептиды. Первые получили большее распространение. Но при плохой очистке в смесь антигенов T. pallidum попадают белки Escherichia coli, что приводит к ложной серодиагностике сифилиса у больных эшерихиозом или здоровых, в сыворотке которых обнаружены антитела к кишечной палочке.

В определенной степени к диагностическим ошибкам следует отнести и неправильную трактовку результатов исследования.

Острые и хронические ЛПР

Помимо технических ошибок при выполнении тестов, ЛПР могут быть обусловлены и особенностями организма. Условно ЛПР разделяют на острые (хронические (сохраняются более 6 месяцев).

Острые ЛПР могут наблюдаться при беременности и во время менструации, после вакцинации, после недавно перенесенного инфаркта миокарда, при многих инфекционных заболеваниях. Инфекции, при которых могут отмечаться ЛПР — пневмококковая пневмония, скарлатина, инфекционный эндокардит, туберкулез, лепра, венерическая лимфогранулема, шанкроид (мягкий шанкр), лептоспироз и другие спирохетозы, ВИЧ-инфекция, инфекционный мононуклеоз, малярия, ветряная оспа, вирусные гепатиты, паротит, корь, респираторные заболевания, грипп и дерматозы.

Хронические ЛПР возможны при аутоиммунных заболеваниях, системных болезнях соединительной ткани, онкологических заболеваниях, хронической патологии печени и желчевыводящих путей, при сердечно-сосудистой и эндокринной патологии, при заболеваниях крови, при хронических заболеваниях легких, при инъекционном применении наркотиков и др. При большинстве этих состояний выявляют антикардиолипиновые антитела классов IgG и IgM («реагины»).

Хронические ложноположительные реакции могут являться преклиническими проявлениями тяжелых заболеваний. При злокачественных новообразованиях, диффузных болезнях соединительной ткани титр ЛПР может быть очень высоким.

Среди причин хронических положительных реакций выделяют физиологические состояния (пожилой возраст). С возрастом количество ЛПР увеличивается, у женщин они наблюдаются в 4,5 раза чаще, чем у мужчин. В возрастной группе 80-летних лиц распространенность ЛПР составляет 10%.

Причиной ЛПР могут быть частое использование вводимых внутривенно препаратов, частые переливания и инфузии.

Хронические инфекции (туберкулез, лепра, инфекционный эндокардит, малярия), миелома также могут стать причинами ЛПР.

Заражение другими видами спирохет

Ложноположительные реакции трепонемных и нетрепонемных тестов могут наблюдаться при инфекционных заболеваниях, возбудители которых имеют антигенное сходство с бледной трепонемой. Это возвратный тиф, лептоспироз, клещевой боррелиоз, тропические трепонематозы (фрамбезия, беджель, пинта), а также воспалительные процессы, обусловленные сапрофитными трепонемами полости рта и гениталий.

Возбудители эндемических трепонематозов (фрамбезия, пинта, беджель) — это трепонемы, которые обладают родоспецифическими антигенами, сходными с антигенами T.pallidum. В связи с этим антитела, образующиеся к ним, способны вступать в перекрестные взаимодействия с антигеном возбудителя сифилиса.

Россия не является территорией, эндемичной по данной группе заболеваний. Эти инфекции встречаются главным образом, в странах Африки, Латинской Америки и Южной Азии, и случаи заболеваний редки в практике лечебных учреждений.

Пациента с положительными серологическими реакциями на сифилис, прибывшего из страны с эндемическими трепонематозами, необходимо обследовать на сифилис и назначить противосифилитическое лечение, если оно ранее не проводилось.

Начиная с 1938 года, и особенно во время Второй Мировой войны, в США стали широко проводиться скрининговые серологические исследования для выявления сифилиса. Исследователи сопоставили полученные данные и выяснили, что положительная или сомнительная реакция обнаруживалась у людей не имевших клинических и эпидемиологических признаков сифилитической инфекции или контактов по сифилису. Причем такие результаты возникали гораздо чаще, чем предполагалось ранее. Положительные результаты нетрепонемных тестов с липидными или кардиолипиновыми антигенами (VDRL, в тестах Колмера, реакции Кана) были обнаружены у пациентов с различными заболеваниями, но не имеющих признаков сифилитической инфекции. Биологические ложнополжительные результаты были выявлены у пациентов с аутоиммунными, воспалительными и гематологическими заболеваниями.

В русскоязычной медицинской литературе этот феномен получил наименование «биологическая ложноположительная реакция Вассермана» (Б-ЛПРВ), т.к. указанные результаты наблюдались при проведении самого распространенного теста тех времен — реакции Вассермана.

Оказалось, что Б-ЛПРВ может встречаться в двух основных вариантах — остром и хроническом. В первом случае у больных, перенесших какую-либо, но не сифилитическую инфекцию, Б-ЛПРВ исчезает в процессе выздоровления, и длительность ее обнаружения не превышает шести месяцев. Во втором случае Б-ЛПРВ может устойчиво сохраняться в течение многих лет в отсутствие очевидного причинного фактора. В начале 50-х годов было установлено, что наиболее часто хроническая Б-ЛПРВ выявляется при аутоиммунных заболеваниях, особенно СКВ, при которой частота ее обнаружения достигает 30—44%

Ложноположительность нетрепонемных (кардиолипиновых) тестов

Липидные антигены T. pallidum cоставляют значительную часть клетки, однако в организме могут присутствовать и имеющие такое же строение липиды – аутоантигены, образующиеся в результате разрушения органов и тканей (в основном липиды митохондриальных мембран).

Сифилитическая инфекция сопровождается образованием иммунных комплексов и аутоиммунным ответом на кардиолипин, фибронектин, коллаген и мышечную креатинкиназу. В нетрепонемных тестах в качестве антигена используют раствор трех высокоочищенных липидов (кардиолипин, стабилизированный лецитином и холестерином) в этиловом спирте. Кардиолипин не является специфичным компонентом для T. pallidum, а также описан как один из фосфолипидов биомембран человека. Поэтому антитела к этому антигену регистрируют в сыворотке практически при любой альтерации клеток человека в результате инфекций и при некоторых физиологических и патологических состояниях.

Так как антиген, используемый в нетрепонемных реакциях, обнаруживается в других тканях, тесты могут давать положительные результаты у лиц без трепонемной инфекции (1—2 % в общей популяции).

Наиболее частой причиной биологических ложноположительных нетрепонемных тестов является антифосфолипидный синдром — аутоиммунный процесс, встречающийся при заболеваниях соединительной ткани (системной красной волчанке, дерматомиозите, склеродермии).

При использовании нетрепонемных тестов (РМП и ее модификаций) ложноположительные результаты могут быть обусловлены наличием в крови антител к ревматоидному фактору, перекрестно реагирующих антител при аутоиммунной патологии («кресс-реактеры»).

Другими факторами возникновения ложноположительных результатов считаются некоторые хронические бактериальные инфекции (лепра и др.), заболевания вирусной этиологии (инфекционный мононуклеоз), системные болезни соединительной ткани.

Причины также могут заключаться в пожилом возрасте (старше 70 лет), беременности, обширной соматической патологии, нарушениях обмена липидов, иммунодефицитных состояниях различной этиологии, системными хроническими заболеваниями сердца, легких.

Среди других причин следует отметить онкологические заболевания, туберкулез, энтеровирусные инфекции, вирусные гепатиты, болезнь Лайма, пневмонии, алкоголизм, наркоманию, сахарный диабет, вакцинацию, другие инфекции (малярия, ветряная оспа, корь, эндо- и миокардиты), подагру.

При этих состояниях отмечается развитие иммунологических нарушений, приводящих к аномальной продукции антител, способных перекрестно реагировать и с трепонемными антигенами.

Ложноположительность трепонемных тестов

Проблема усугубляется тем, что трепонемные тесты также могут быть ложноположительными. Причинами могут являться аутоиммунные заболевания, коллагенозы, болезнь Лайма, беременность, лепра, герпес, малярия, инфекционный мононуклеоз, опухоли, наркомания. В последние годы для дифференциации ЛПР за рубежом начали активно использовать иммуноблоттинг — один из самых современных методов диагностики сифилиса.

Сохранение антител после успешного лечения

Специфические диагностические реакции длительное время остаются положительными даже после полноценной терапии. После эффективного лечения сифилитической инфекции, у большинства больных титры в нетрепонемных тестах снижаются в 4 раза через 6–12 месяцев после лечения. Однако, при позднем начале терапии, титры даже в нетрепонемных тестах могут сохраняться на прежнем уровне, но никогда не увеличиваться.

Ложноотрицательные результаты анализов

Различные методы диагностики демонстрируют различную чувствительность и специфичность в зависимости от формы и стадии сифилиса. Вероятность ошибочного диагноза возрастает, особенно в случаях латентного, скрытого, сочетанного течения заболевания.

Ложноотрицательные серологические реакции на сифилис могут наблюдаться при вторичном сифилисе вследствие феномена прозоны при тестировании неразведенной сыворотки, а также при обследовании лиц с иммунодефицитным состоянием, например ВИЧ-инфицированных пациентов.

Ложноотрицательные результаты серологических специфичес- ких реакций (РПГА), вызванные биологическими факторами, могут быть обусловлены конкуренцией между специфическими IgM и IgG за связывание с антигеном на поверхности эритроцитов, а также «феноменом прозоны». В последнем случае агглютинация не происходит из-за гиперпродукции антител к бледной трепонеме, поскольку каждый антиген-рецептор на эритроцитах из-за избытка антител связан с одной молекулой агглютинина, что препятствует образованию «решетки». Замена РПГА на TPPA, т.е. эритроцитов на синтетические частицы, видимо, исключит или минимизирует получении ложноотрицательных результатов.

В ИФА такие реакции можно объяснить наличием серонегативной фазы при первичном сифилисе, а при вторичном — иммунной недостаточностью, наличием ВИЧ-инфекции. При получении отрицательного результата серологических исследований на сифилис следует учитывать свойство бледных трепонем проникать и размножаться в различных органах и тканях — поиск возбудителя в лимфе (лимфатических узлах) в ряде случаев приводит к достоверному результату. Целесообразно повторить также анализ образцов, давших положительный результат. Повторное, через 5–7 и более дней, исследование сывороток, как правило, позволяет получить достоверные результаты.

Анализы на гепатит С

Вирусный гепатит долгое время может протекать без симптомов, поэтому часто гепатит С выявляется случайно при рядовом обследовании.

Разберемся, какие показатели и в каком порядке сдавать при подозрении на гепатит С, что означает каждый анализ и какое обследование еще может понадобиться.

Анализы крови при гепатите C

1. Антитела к гепатиту С (anti-HCV). Если вы подозреваете, что можете быть заражены вирусом или хотите провериться, то это первый анализ крови, который нужно сдать. Антитела — это маркер того, что иммунная система вашего организма знакома с вирусом и выработала защитные антитела к нему. Однако наличие антител еще не говорит о болезни.

После попадания вируса гепатита в кровь формируется острая форма гепатита С, у которой есть 2 возможных исхода:

1. По различным данным в 15-40% случаев происходит спонтанное излечение. Антитела остаются в крови навсегда.
2. В остальном большинстве острая форма гепатита становится хронической (ХВГС).

2. Качественный анализ на вирус гепатита С (РНК вируса) методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) — следующий этап обследования, в случае выявления антител к вирусу гепатита С. Анализ выявляет генетический материал вируса (РНК). Положительный результат свидетельствует о присутствии и размножении вируса в крови и о необходимости лечения.

Вирус определяется в среднем через 2-6 месяцев после заражения. Чтобы убедиться, что активного вируса в организме нет, необходимо сдавать анализ на антитела через 3, 6 и 12 месяцев после предполагаемого заражения.

3. Количественный анализ на гепатит С методом ПЦР — следующий этап. Выявление количества копий/МЕ вируса на 1 мл крови (вирусная нагрузка) очень важно для оценки активности вируса, прогноза течения заболевания и, в последующем, оценки результативности терапии.

В клинике ЭКСПЕРТ качественный и количественный анализ выполняется наиболее точным методом молекулярно-биологического анализа в условиях лаборатории Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями.

Одновременно с количественным анализом следует провести генотипирование вируса. В России встречаются 1, 2, 3 и 4 генотипы вируса гепатита С. От результата этого анализа полностью зависит выбор препаратов для лечения заболевания.

После успешного прохождения лечения качественный анализ рекомендуется сдавать в течение 1 года в качестве контроля и далее 1 раз в год.

Другие виды диагностики при гепатите C

Вирус гепатита С преимущественно поражает клетки печени, поэтому при его выявлении необходимо полноценное обследование этого органа.

1. Вирусологические диагностика дополняется клиническим и биохимическими показателями (АЛТ, АСТ, общий и прямой билирубин, ГГТП, щелочная фосфотаза и прочие — список формирует лечащий врач). Этот набор анализов сдается регулярно: перед началом, раз в месяц во время и в течение года после лечения. Это необходимо для контроля состояния печени и ее реакции на терапию.
2. Инструментальная диагностика, в первую очередь подразумевающая УЗИ органов брюшной полости с эластографией печени. Врач УЗ-диагностики в заключении описывает форму, размер, положение, структуру печени и желчного пузыря, а при помощи эластографии — стадию фиброза/цирроза печени.
3. Дополнительно врач может назначить специальный тесты ФиброМакс или ФиброАктиТест. Это комплексный анализ крови, также необходимый для диагностики фиброза, стеатоза печени и активности разрушительных процессов.

Независимо от того, беспокоят ли вас симптомы, гепатит С подлежит лечению. Без лечения со временем заболевание может привести к циррозу, раку печени и даже к летальному исходу. Тяжелая стадия цирроза может потребовать трансплантации печени.

В клинике ЭКСПЕРТ вы получите полноценное и только необходимое обследование, развернутую консультацию врача и помощь на всех этапах лечения гепатита С.

Вопросы о диагностике гепатита С

Сколько делаются анализы на гепатит C?

Срок выполнения анализов в клинике ЭКСПЕРТ:

• anti-HCV — 2-3 рабочих дня
• молекулярно-биологическое исследование HCV (качественный анализ) — 5-6 рабочих дней
• молекулярно-биологическое исследование HCV (количественный анализ) — 8-9 рабочих дней
• анализ на генотип гепатита С — 5-6 рабочих дней.

Что значит неопределенный или сомнительный результат?

Сомнительный анализ на гепатит С может быть при следующих условиях:

• недостаточное количество биоматериала (крови) на анализ
• повреждение биоматериала
• недостаточная подготовка пациента перед сдачей анализа (любые анализы лучше сдавать натощак!)
• наличие другой активно протекающей инфекции в момент сдачи анализа
• заражение гепатитом С произошло недавно и еще не закончился инкубационный период.

При сомнительном результате анализ необходимо сдать повторно через 2-4 недели.

Что такое ПЦР?

ПЦР — полимеразная цепная реакция — метод молекулярной биологии, суть которого заключается в многократном умножении участка РНК вируса гепатита С в лаборатории. В результате количества биологического материала становится достаточно для визуального изучения.

Где сдать анализ на гепатит С?

Сдать анализы на вирусный гепатит можно в большинстве лабораторий Санкт-Петербурга, а также в специализированной клинике. В клинике ЭКСПЕРТ врач-гепатолог поможет интерпретировать результаты и при необходимости назначит лечение.

Гепатит C. Описание заболевания.

Гепатит С – это медленно прогрессирующее инфекционное, вирусное заболевание печени с гемоконтактным механизмом передачи возбудителя (передается при контакте с инфицированной кровью). В 50-80% случаев гепатит С приводит к хроническому поражению печени.

Возбудитель гепатита C

Вирусный гепатит С (ВГС) вызывается РНК-содержащим вирусом (HCV), относящимся к семейству Флавивирусов (Flaviviridae). Вирус имеет липидную оболочку, сферическую форму, средний диаметр составляет 50 нм, нуклеокапсид содержит однонитевую линейную РНК В различных регионах Земли циркулируют разные генотипы вируса. Генотип не влияет на исход инфекции, но позволяет предсказать эффективность лечения.

Отличие этого вируса по сравнению с другими вирусами, поражающими печень, является его довольно быстрая мутационная изменчивость под воздействием лекарственных препаратов, других бактерий и вирусов, и многих других причин. Такая быстрая перемена приводит к тому, что вирус скрывается от иммунной системы, а при этом антитела (защитные элементы организма) не способны полностью уничтожить вирус. Это помогает длительному (возможно, пожизненному) пребыванию вируса гепатита С в организме человека. Ученые доказали, что вирус поражает не только клетки печени, но и клетки крови — лейкоциты.

Пути передачи гепатита C

Передача вируса гепатита С осуществляется через кровь, например, вследствие различных внутривенных вмешательств, через нестерильные медицинские инструменты, от серопозитивных матерей к плоду и т. д. Заражение может происходить:

• при переливании крови или ее препаратов,
• инъекционном употребление наркотических и других веществ (когда используется не одноразовые шприцы),
• в результате проведения медицинских манипуляций (когда не соблюдаются правила стерилизации медицинского инструмента),
• при бытовом контакте с инфицированной кровью (например при нанесении татуировок, ритуальных надрезов, при проведении пирсинга, маникюра, педикюра и т.д.)

Группами риска для заражения вирусным гепатитом С являются больные, которым переливали кровь, больные гемофилией и наркоманы. Также возможен и половой путь передачи, но он встречается значительно реже по сравнению с внутривенными процедурами. При большом числе половых партнёров вероятность заражения возрастает.

Симптомы и течение гепатита C

Отличительной особенностью гепатита С от других гепатитов является то, что по клиническому течению он протекает в основном стертыми формами течения болезни (безжелтушными), в отличие от вирусных гепатитов А и В, при которых одним из главным симптомов изначально является желтушное окрашивание кожных покровов. Только у одной трети инфицированных имеются какие-либо симптомы и даже они обычно маловыражены. У многих инфицированных людей симптомы могут не проявляться годами. Однако при этом повреждение печени все же происходит.

При гепатите С в основном жалобами являются общая слабость, повышенная утомляемость, незначительное повышение температуры тела. У некоторых людей возникают такие симптомы, как желтизна кожи и глаз. И именно появление желтухи приводит больного к врачу.

При обследовании (УЗИ) выявляется плотная и значительно увеличенная печень и селезенка. При этом самочувствие и клиническое состояние больного не соответствует степени поражения этих органов т.к. на фоне малосимптомной клинической картины довольно часто развивается злокачественное перерождение печени в цирроз. При циррозе соединительная ткань разрастается и замещает нормальную ткань, нарушая такие важные функции печени как пищеварение и детоксикацию. Цирроз развивается приблизительно у 20% людей, инфицированных вирусом гепатита С, причем такое перерождение клеток печени при гепатите С происходит значительно чаще, чем при других гепатитах. Именно поэтому медики называют вирусный гепатит С — «ласковый убийца».

Течение и осложнения гепатита C

При естественном течении ВГC 20–25% больных спонтанно выздоравливают, у остальных 75–80% происходит развитие хронической формы этого заболевания. Факторы, связанные со спонтанной элиминацией вируса: молодой возраст, женский пол и определённое сочетание генов главного комплекса гистосовместимости.

При затяжном течении в процесс болезни вовлекаются почки (гломерулонефрит), появляются различные кожные высыпания, возникают ревматоидные симптомы, накапливается жидкость в полостях, в основном, в брюшной (асцит). Прогрессирование заболевания гепатита С происходит крайне медленно. Хронический гепатит может развиваться более 10 лет после заражения, а цирроз (злокачественное перерождение клеток печени) — спустя несколько десятилетий. Отмечают, что скорость прогрессирования заболевания печени НЕ связана с имеющимися у человека генотипом вируса или количеством вирусов.

Эксперты выделяют несколько факторов, которые могут быть связаны с более быстрым прогрессированием заболевания:

• пожилой возраст на момент инфицирования
• мужской пол
• употребление алкоголя (вина, пива, крепких напитков)
• ко-инфекция вирусом гепатита В (HBV) или вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)
• избыточный вес
• наличие диабета
• курение

Диагностика вирусного гепатита C

Диагностика вирусного гепатита С в первую очередь устанавливается на сборе анамнеза: заболевание гемофилией, проведение манипуляций, операций, употребление наркотических препаратов и других факторов. Диагноз подтверждается определением в крови больного специфических антител к вирусу гепатита С.

2) биохимическое исследование крови для определения активности ферментов – (АЛТ) и (АСТ); при наличие заболевания, их значения в несколько раз превышают установленные нормы.

5) пациентам, имеющим диагностические критерии хронического гепатита показана пункционная биопсия печени.

6) инструментальные исследования (УЗИ органов брюшной полости, рентгенография органов грудной клетки)

Лечение гепатита C

Лечение хронического гепатита C сегодня намного более успешно, чем еще десять лет назад. При хроническом гепатите С проводят противовирусную терапию, направленную на снижение вирусной нагрузки (подавление репликации вируса, уменьшение концентрации вируса в организме) и симптоматическую терапию, улучшающую качество жизни и поддерживающую функцию печени.

Притивовирусные препараты могут назначаться как в монотерапии, так и в сочетании с интерферонотерапией. В новых Международных рекомендациях по лечению хронического гепатита С, сказано, что пегилированный интерферон и рибавирин считаются стандартными препаратами для лечения заболевания.

Хорошую эффективность при лечении гепатитов показали новые российские противовирусные препараты, механизм действия которых основан на том, что они взаимодействует с мембранами клеток и конкурируют за рецепторы, с помощью которых происходит прикрепление и проникновение вирусов внутрь клетки. Их назначение, способствует выработке организмом собственного интерферона, который также обеспечивает защиту от вирусов.

Помимо противовирусной терапии осуществляют и симптоматическое лечение с назначением препаратов улучшающих кровообращение, гепатопротекторов, при необходимости проводится дезинтоксикационная терапия.

Гепатит С: какие анализы нужно сдать

Согласно эпидемиологическим данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на 2017 год в мире насчитывается около 150 миллионов человек, которые были инфицированы вирусом гепатита С. Гепатит С — это опасное вирусное заболевание печени. Этот вирус может приводить к развитию как острой, так и хронической формы гепатита, которая варьируется по тяжести – от легкой болезни, продолжающейся несколько недель, до серьезной пожизненной болезни. При своевременной диагностике и правильно подобранном лечении данная патология полностью излечима, особенно, если не медлить со сдачей анализов на выявления гепатита С в крови. Иначе последствия могут быть трагическими — гепатит С часто приводит к развитию необратимых изменений, потенциально угрожающих для жизни.

Благодаря наличию в своих стенах современного медицинского оборудования, Юсуповская больница занимается диагностикой всех видов вирусных гепатитов. В клиники терапии каждому пациенту окажут не только квалифицированную помощь от специалистов высшей категории с многолетним стажем работы, но и понимание, поддержку в его нелегкой борьбе с ужасным заболеванием.

Гепатит С: что нужно знать пациенту

Гепатит С — один из самых коварных и смертельных вирусов. В 90% случаев протекают бессимптомно. Из-за способности маскировать истинную причину под видом множества других заболеваний, его прозвали «ласковый убийца». Если болезнь все-таки дала о себе знать, активная ее фаза делится на два основных периода: преджелтушный и желтушный. В первом (раннем) периоде отмечаются такие характерные для вирусных инфекций симптомы, как:

• общая слабость;
• кожный зуд;
• расстройства пищеварения: тошнота, рвота, диарея;
• повышение температуры тела до 38°С;
• головные боли, миалгия, артралгия.

На втором (желтушном) периоде, когда поражена печень, в кровь выбрасывает большое количество билирубина — желтого пигмента. Именно благодаря иктеричному окрашиванию кожных покровов пациента становится очевидно, что у него присутствуют явные проблемы с печенью, и назначается комплекс лабораторных исследований крови, мочи и кала.

Однако многие случаи заражения протекают бессимптомно, без характерной клинической картины. После инкубационного периода, который длиться от пары недель до пары месяцев, пациент может и не подозревать, что он является носителем вируса не только в продромальной (преджелтушной) стадии, но и в желтушной — по причине отсутствия ее как таковой. Например, в 2/3 всех случаев гепатит С проходит в атипичной (безжелтушной, или субклинической) форме.

Анализ гепатит С: особенности и подготовка

Всегда кровь на биохимический анализ сдается строго натощак, непосредственно в утренние часы, до полудня. Это обусловлено суточными ритмами в организме человека, которые влияют на содержание гормонов в крови. Количественный анализ на гепатит С (антигены и антитела) сдается в любое время суток, но тоже, обязательно, натощак: важно не принимать пищу в течение 4–6 часов до забора крови. В обоих случаях используется венозная кровь, которая как биоматериал более качественна, чем капиллярная либо артериальная.

Накануне сдачи любых анализов крови рекомендуется избегать чрезмерных физических и психоэмоциональных нагрузок, приема алкоголя и тяжелой пищи. Питьевой режим должен быть обычным.

Количественные и качественные анализы на гепатит С

Этот вид гепатита имеет шесть разновидностей, поэтому анализы необходимо проводить в комплексе. К группе риска относятся люди, принимающие внутривенные наркотики (кокаин, героин), ведущие беспорядочную половую жизнь, медработники (особенно хирурги и анестезиологи), а также пациенты, которым показаны гемодиализ или переливания крови.

В профилактических целях либо при подозрении вирусное поражение печени сдаются следующий качественный и количественный анализ на гепатит С:

• Анализ на anti-HCV-total (антитела к антигенам вируса гепатита C). Качественный анализ. Положительный результат означает инфицирование или период восстановления после перенесенной инфекции. Отрицательный результат — инкубационный период;
• Определение РНК (HCV-RNA) в сыворотке или плазме крови. Может быть качественным и количественным. При качественном анализе результат «обнаружено» подтверждает заражение гепатитом C. Отрицательный результат говорит об отсутствии вируса в крови пациента;

При количественном анализе плазмы крови на гепатит С:

• «не обнаружено»: РНК гепатита С не выявлена;
• 100 000 000 МЕ/мл: результат интерпретируется как: «РНК гепатита С выходит за пределы линейного диапазона, тест ставился в разведении 1: Х».

При количественном анализе сыворотки крови на гепатит С:

• «не обнаружено»: РНК гепатита С не выявлена;
• 2 до 10 8 МЕ/мл: результат положительный;
• 10 8 МЕ/мл: результат положительный, концентрация РНК гепатита С более 108 МЕ/мл.
• Определение антител IgG (recomBlot HCV IgG). Качественный тест. Отрицательный результат говорит об отсутствии инфицирования. Положительный результат — пациент был инфицирован ранее. Сомнительный результат — возможно, была инфекция.

Расшифровка анализа крови на гепатит С

Расшифровка анализа крови на гепатит С и верификация диагноза, с учетом клинической и эпидемиологической картины, под силу только специалисту.

При отрицательном результате в крови, по итогам всех проведенных тестов, не находят никаких маркеров вирусного гепатита. Тогда можно говорить об отсутствии заболевания. Однако в некоторых случаях врачи рекомендуют сделать анализы повторно через две недели.

При положительном результате анализа на гепатит проводится повторный уточняющий анализ через две-три недели. Возможен вариант, когда пациент только что переболел острой формой вирусного гепатита и маркёры в крови пока еще сохраняются.

Анализ на гепатит С: цена, Москва

Стоимость анализа на гепатит С в частных клиниках Москвы варьируется в диапазоне от 500-2000 рублей. Качественный анализ на гепатит С стоит в среднем 700 рублей. Количественный анализ на гепатит С методом ПЦР обойдется жителям Москвы примерно в 2500 рублей.

Юсуповская больница специализируется на диагностике и проведении анализов на выявление всех типов вирусных гепатитов. В стационаре клиники работает собственная современная лаборатория, сотрудники которой постоянно усовершенствуются в своей профессии и проходят специальные курсы по повышению квалификации. В больнице разрабатывают новые медикаментозные методики лечения различных видов вирусных гепатитом, в том числе и гепатит С. Ответственность перед каждым пациентом и высокий уровень профессионализма сотрудников – это визитная карточка Юсуповской больницы. Для записи на прием, звоните по телефону.

Когда и как нужно провериться на сифилис. Как узнать время заражения

Врач гинеколог-онколог. Руководитель сети Университетских клиник. Эксперт по патологиям вульвы и шейки матки, ведущий консультирующий врач в Центре патологии шейки матки в Санкт-Петербурге. Стаж 20+ лет. Принимает в Университетской клинике. Стоимость приема 2500 руб.

• Запись опубликована: 08.04.2019
• Reading time: 3 минут чтения

Понятие «звездная болезнь» в начале XX века было связано далеко не со знаменитостями. Так в те годы называли сифилис. При этом заболевании на теле появляется мелкая сыпь, похожая на звёздочки. Болезнь даже была описана в рассказе М. Булгакова «Звездная пыль».

Ситуаций, характерных для начала прошлого века, когда сифилисом болели целые деревни, сейчас уже нет. Но это не значит, что заболевание кануло в Лету.

Как возникает сифилис и легко ли им заразиться

Помните шутку, когда в анализах нашли только спирохету, и то какую-то бледную. Действительно, сифилис вызывается бледной трепонемой, относящейся к роду спирохет. Однако этот микроорганизм, называемый на латыни Treponema pallidum, шутить не любит, приводя к серьезным осложнениям. В отличие от других возбудителей венерических заболеваний, он передается не только половым, но и бытовым способом. Поэтому подхватить болезнь можно при обычном контакте.

Чаще всего бытовой формой заражаются дети, но ее могут подхватить и взрослые. Заражение происходит при пользовании общей посудой, предметами обихода, бельем. Подцепить инфекцию можно даже в парикмахерской, маникюрном или тату-салоне, если там не сильно «заморачиваются» гигиеной и стерилизацией.

Инфекция, которая бушевала в 90 годах и позже, пошла на спад, сейчас опять подняла голову и грозит практически любому. Трепонема живёт и процветает, в частности, благодаря наплыву нелегальных трудовых мигрантов, состояние здоровья которых иногда не проверялось по многу лет. Больной не только губит свое здоровье, но и становится источником заражения для окружающих – коллег, членов семьи.

Симптомы заболевания. Когда лучше остаться с носом

Болезнь начинается примерно через 3-6 недель после заражения. На коже или слизистой появляется твердый шанкр – язва с плотным дном и плотными приподнятыми краями, напоминающими валик. Размеры ее могут быть разными – от 3 мм до 4 см. Иногда возникают два шанкра на разных частях тела. Появление язв сопровождается увеличением лимфоузлов.

Образование не болит, что отличает его от других изъязвлений. Поэтому первое, что должно насторожить – появление странного, долго не проходящего, плотного безболезненного очага, сопровождающегося увеличением лимфоузлов.

Иногда язвы возникают не на коже и слизистой, а в женских половых путях или прямой кишке. В этом случае они выдают себя болями, выделениями из влагалища и появлением крови при дефекации. Шанкр может появиться и в глотке, вызывая охриплость голоса и другие симптомы, похожие на ангину или ларингит.

Любые выделения из половых путей и боль при дефекации должны стать причиной обращения к гинекологу или проктологу. Врач проведет осмотр и при необходимости направит на анализ.

Даже при отсутствии лечения язвочки постепенно затягиваются. Но это не значит, что болезнь прошла. Примерно через 10 дней начинается вторичный период – на теле появляется обильная бледно-розовая сыпь, похожая на звёздное небо. Снова увеличиваются лимфоузлы. В паховой области появляются наросты – широкие кондиломы, в которых содержится возбудитель. В отличие от остроконечных кондилом, эти наросты имеют более темный цвет, а при надавливании выделяют жидкость.

Высыпания на теле и половых органах, особенно сопровождающиеся увеличением лимфоузлов, – повод провериться на это заболевание.

Если проигнорировать симптомы и не начать лечиться, возникнет третичная форма болезни с поражением нервов, костей, выпадением волос, появлением незаживающих язв. Часто при этом разрушаются носовые кости. У пациента проваливается переносица и возникает «нос бульдога» – типичный признак запущенной болезни.

Заражение во время беременности приводит к рождению больных детей, которые часто умирают в первые дни или месяцы жизни.

Нужно ли сдавать анализ при отсутствии симптомов

Поскольку заболевание очень опасно, на него нужно периодически проверяться даже при отсутствии симптомов. Анализ проводится:

• При возможности заражения, например, при сомнительных половых отношениях или обнаружении болезни у контактных лиц.
• На этапе подготовки к оперативным вмешательствам.
• При планировании беременности .
• При проведении медосмотров и профилактическом обследовании сотрудников, работающих с пищевыми продуктами и обслуживающих население.
• При всех видах донорства.

Подготовка к анализам

Диагностика проводится строго натощак. За 30 минут до проведения диагностики нельзя курить. Других ограничений для проведения процедуры нет. Для большинства исследований берется кровь из вены, но при некоторых методиках она может браться и из пальца.

Методы обнаружения болезни

Микрореакция, RPR-реакция – современный вариант известной реакции Вассермана. Это быстрый и простой метод, применяемый при профилактических осмотрах и других случаях первичной диагностики.

Анализ достаточно точен, но иногда дает ложноположительные реакции, связанные с особенностями организма пациента и сопутствующими болезнями. В этом случае результат перепроверяется с помощью других методик.

ПЦР-реакция находит трепонем по участкам их генного материала. Метод позволяет обнаружить спирохеты даже при небольшой их концентрации. Анализ практически не дает ложноположительных и ложноотрицательных результатов, поскольку реактивы, применяемые для его проведения, срабатывают только на этого возбудителя.

Иммуноферментный метод (ИФА), основанный на обнаружении антител к трепонеме. Любой микроорганизм, в том числе и возбудитель сифилиса, является чужеродным для организма, поэтому иммунная система в ответ на его внедрение выделяет особые белковые соединения – антитела:

• Иммуноглобулины класса М (IgM), первыми вступающие в борьбу с непрошенными «гостями».
• Иммуноглобулины класса G (IgG), выделяющиеся позже – в разгар болезни.

ИФА-метод применяется в качестве уточняющего при положительной микрореакции, а также при исследовании контактных лиц и доноров. Однако его можно использовать и в качестве первичного анализа.

Соединяясь с антигенами трепонем, они образуют структуры, которые и обнаруживаются в анализе. При проведении анализа можно определить не только наличие антител, но и их концентрацию, зарегистрировав ее рост или снижение. Для этого придется обследоваться несколько раз.

Определение примерного времени заражения по концентрации IgM и IgG

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) – методика, при которой также выявляются антитела в сыворотке крови. Для этого используются специальные реактивы на основе бараньих эритроцитов, реагирующие на антитела (IgM) (IgG), вырабатываемые организмом при сифилисе.

При обнаружении возбудителей образец становится темно-красным за счет склеивания красных кровяных телец. Тестирование имеет 96-100% точность. Ошибки случаются при тяжелых инфекциях и системных заболеваниях типа красной волчанки. В этом случае результат проверяется с помощью других методик.

РПГА и ИФА-анализы, основанные на исследовании плазмы крови, дают результаты даже до появления первых симптомов болезни. Их также применяют для контроля излеченности.

Поскольку разные виды антител появляются на разных этапах развития инфекции, определив концентрацию IgM и IgG, можно узнать примерно, когда произошло заражение.

При любых подозрениях на возможность заражения сифилисом лучше перестраховаться и сдать анализы. Лабораторная диагностика позволит вовремя выявить инфекцию и пролечиться, избежав тяжелых осложнений.